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分子間相互作用分析技術---微量熱泳動儀（MST）
閱讀：4182 發布時間：2021-1-23
分子間相互作用分析技術---微量熱泳動儀（MST）
微量熱泳動儀-microscale thermophoresis (MST)是由總部設在慕尼黑的德國高科技公司NanoTemper技術有限公司發明的設備。2010年底的一篇Nautre的文章《Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis》報道了NanoTemper公司創始人Dr. Stefan和 Dr. Philipp使用MST測量生物溶液中蛋白-蛋白之間的相互作用，引起了很多科研人員的興趣。隨后這個產品正式投入市場，在2011年就有很多客戶購買試用，2012年就有130個國外的實驗室購買使用。而且在短短的一年多的時間內，相關數據已經發表到nature，cell，PNAS等期刊，大大受到用戶們的歡迎。
MST背景技術介紹
微量熱泳動是粒子在微觀的溫度梯度中的定向運動。通過測量水化層的變化（通常是由生物分子結構/構象的變化引起的）而導致的微量熱泳動的變化來確定親和力。甚至像蛋白質磷酸化或小分子結合到靶標上這些微小的變化都可以被測量到。MST也允許直接在溶液中測量分子間相互作用，而不需要一個固定的表面（無需固定）。MST是由總部設在慕尼黑的德國高科技公司NanoTemper技術有限公司發展出來的。
微尺度熱泳（MST）是一種新的方法，可以定量分析溶液中微升的分子間的相互作用。MST是基于微量熱泳動效應，即沿溫度梯度定向的分子運動。一個空間的溫度差ΔT導致分子濃度在溫度升高的地區的變化，用Soret系數ST定義為：C熱/C冷= EXP（-STΔT）。
熱泳動取決于分子和溶劑之間的界面。在恒定的緩沖條件下，熱泳動反映出分子大小，電荷和溶劑化熵。 一個熒光標記分子A的熱泳動由于大小、電荷和溶劑化熵的差異通常明顯不同于分子A和靶標T形成的復合物AT。這種熱泳動的區別可以用來通過梯度滴定實驗，在一定緩沖條件下，測量計算出分子間的結合常數。
測量熒光標記分子的熱泳運動是通過監測毛細管內的熒光分布F。紅外激光產生微觀的溫度梯度。溶液在激光光斑處的溫度升高ΔT= 5 K，之前的紅外激光是在同質化的熒光分布F是毛細管內觀察到的冷切換。當紅外激光打開后，兩方面因素影響熒光的分布（熱弛豫時間和熒光標記分子的熱泳動），但是由于其時間尺度分離（熱弛豫時間很短和熒光標記分子的熱泳動時間較長），有利于我們測量熒光分布F熱。在較慢的熱泳動時間內（10秒），分子運動從局部加熱區域移往四周的低溫地區，中心區域的分子濃度降低，由于質量擴散效應的反作用，后分子的分布直到達到一個穩定態。
雖然質量擴散D的決定消耗的動力學，S、T確定的穩態濃度比例下溫度上升Chot/Ccold=exp(-ST ΔT) ≈ 1-STΔT。歸一化熒光Fnorm= F熱/ F冷主要是這個濃度比，除了溫度跳躍∂F /∂T的線性近似，我們發現：Fnorm= 1 +（∂F /∂TST）的溫差。由于熒光強度的線性和熱泳枯竭，Fnorm（A）未結合的分子歸熒光和約束復雜的Fnorm（AT）線性疊加。 表示x的綁定到目標分子的一小部分，在目標T滴定的熒光信號不斷變化的計算公式如下：Fnorm=(1-x) Fnorm(A)+x Fnorm(AT)。
定量綁定參數獲得通過的約束力基板的連續稀釋。通過繪制F規范對系列稀釋的不同濃度的對數，獲得一個S形的結合曲線。這種結合曲線，可以直接安裝質量作用定律的非線性解與解離常數K ð，作為結果。微量熱泳（MST）是一種分析生物分子的技術。微尺度熱泳是粒子在微觀的溫度梯度中的定向運動。
實驗流程
很簡單的實驗方法，使用便宜的毛細吸管作為耗材，避免了昂貴的樣品消耗和繁瑣的制備過程。相對于其他的已有的測量分子間相互作用的技術，MST結合毛細管使用大大降低所需的實驗成本，并且可以測量天然狀態環境中的生物分子間的相互作用。
熒光分子的濃度的保持不變而結合物分子的濃度梯度增加。將6ul的樣品量被填充在MST毛細血管，然后使用制造一個局部溫度梯度。由于標記分子在玻璃毛細管中的運動導致的區域熒光強度變化就會被觀測到。既可用標記的熒光染料/融合表達的熒光蛋白來發光(NT.115系統)，也可以用色氨酸自發熒光來檢測(NT.LabelFree系統)。通過檢測不同濃度的結合物分子對熒光分子熱泳動平衡態的分布的影響，從而獲得這兩個分子間相互作用的各種參數。
熒光分子初是自由均勻分布的。在紅外激光照射下，分子受到熱泳動的作用力，從加熱區域向低溫區域移動，同時分子又受到濃度梯度和質量擴散力的作用，后分子在熱泳動作用力和質量擴散作用力下達到平衡，形成穩定態。在關閉紅外激光后，分子擴散重建均勻分布狀態。下圖顯示了該過程。
主要特點
樣品處理方面：
☆ 不需要固定，在生物溶液中測量，無需純化
☆ 無需標記測量
☆ 使用熒光染料/熒光蛋白具有良好的選擇性
☆ 極低的樣品消耗量
☆ 直接在脂質體或者去污劑中研究膜蛋白
☆ 研快速簡單的實驗準備
測量數據方面：
☆ 10分鐘之內測量任何（生物）分子間親和力(KD, 解離常數)
☆ 測量sub-nM到mM 級的解離常數
☆ 可以選擇特定溫度下完成測量
☆ 研究各種不同大小的分子：離子、片段、核小體、脂質體
☆ 可以在各種不同的溶液環境中完成測量，包括研究膜蛋白所需的復雜的去污劑環境
☆ 廣泛的樣品兼容性：天然的環境中、生理學實驗條件、血清、細胞裂解液
☆ 可以研究多組分反應：三元復合物、裝配順序、干擾因素、協同作用、類似物
☆ 可以區分靶標上不同的結合位點
☆ 可以測量生物分子的寡聚化
☆ 研究化學計量學并確定生物分子結合位點的數目
☆ 研究結合能量學ΔG (自由能 )，ΔH (焓) 和ΔS (熵)
☆ 研究蛋白的折疊和穩定性
實驗操作方面：
☆ 非常簡單易操作
☆ 實時獲得數據
☆ 非常穩定的技術
維護費用方面：
☆ 非常低的運行成本
☆ 不需要日常的儀器維護
☆ 更快得到數據用于發表文章
☆ 儀器小型化設計，占用空間少
分子間相互作用分析技術---微量熱泳動儀（MST）
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