時間分辨熒光免疫分析原理

熒光法是一種非常有用的工具，各種各樣的分析領域都在利用它。由于它具有高靈敏度、好的選擇性以及可提供多參數信息（如，熒光強度、熒光壽命、熒光各向異性）等特點，所以被廣泛用于生物制藥研究、臨床診斷、宇宙空間環境監測、免疫分析中分子間作用原理研究、DNA序列分析、熒光原位雜交以及細胞成分分析等。鑭系系復合物由于其*的熒光特性，而受到廣泛關注，特別是在臨床生化分析中。利用鑭系元素的熒光特性，構建時間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA）試劑以及創建新的靈敏度高的熒光免疫分析方法（fluoroimmunoassay）是當今臨床生化的主要研究方向。

1、熒光基本原理：

化學體系的光致發光提出較早，光致發光有兩種常見的類型熒光和磷光，它們都是化學體系被電磁輻射所激發，然后發射出相同或較長波長的輻射。其中磷光，從分析角度看，意義不是很大。熒光由于其固有的靈敏性而受到人們的偏愛。

熒光標記方法的檢出限可達10-15～10-18水平。簡單和復雜的氣態、液態和固態化學體系均可發熒光。簡單的熒光有稀的原子蒸氣發出，經過10-8秒后電子回到基態同時發出兩種相同的輻射，這稱為共振熒光。有些物質受激后發射出波長較長的特征輻射，這種現象叫Strokes位移。熒光現象只限于相當少數其結構和環境特點使其*弛豫或活化過程的速率減慢到發射反應可在動力學上與其相匹配程度的體系。

熒光發射又稱為去活化過程，它受發射速率和振動弛豫影響。熒光發射是激發過程的逆過程，所以受激態壽命和對應于激發過程的吸收峰的摩爾吸收系數之間存在一個倒數關系，實驗證明摩爾吸收系數在103～105時，熒光去活化的壽命為10-7～10-9秒。

振動弛豫即在電子激發過程中分子可被激發到任何振動能級，但在溶液中，過量的振動能量會由于受激組分的分子與溶劑分子間的碰撞而馬上消失，結果能量轉移只是使溶劑的溫度有一個微小的改變。影響熒光的因素有量子產率、熒光躍遷類型、熒光物質的結構、溶液的溫度和溶劑效應、溶液的PH值以及溶解氧的含量等。量子產率是發射熒光分子的數目與受激態分子總數之比。

熒光躍遷類型指鍵的躍遷，一般σ*—σ躍遷產生熒光很少見，表現為熒光很少由吸收波長小于205nm的紫外輻射引起，而主要限于π*—π、π*—η躍遷。一般含有芳香官能團的化合物發射熒光強度大，簡單的雜環化合物如吡啶、呋喃和吡咯等不發射熒光，稠環化合物一般發射熒光。實驗發現剛性結構的分子容易發射熒光，同時有機絡合劑與金屬離子形成絡合物使發射熒光增強。大多數熒光效率會隨溫度增加而增加。溶劑的極性對熒光強度也有影響，一般成正比關系。

PH對熒光有較大的影響，一般因物質而異，所以熒光為基礎的分析需要嚴格控制PH值。溶解氧的存在可使熒光強度降低。常見的熒光素發射熒光由由以下幾個過程的綜合結果（見圖1.1以Eu3+為例）。在外激發階段，熒光團吸收外激發光所提供的能量，由于分子振動，使熒光團從基態（S0）躍遷到激發態。在這種狀態下，大部分熒光團迅速釋放能量，通過內轉換（非放射衰減）轉變為低的振動水平S1，這個過程產生熒光發射譜。

時間分辨熒光免疫分析原理

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