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武漢原生原代生物醫藥科技有限公司

PriCells: 原代細胞核基質的制備

時間:2021-11-3 閱讀:224
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PriCells: 原代細胞核基質的制備                                                                              


試劑和器材: 
1. 硫酸銨(含10mmol/L Tris-HCl,(pH7.4)及0.2mmol/L MgCl2的1mol/L與0.2mol/L硫酸銨溶液);
2. 氯化鎂(1mol/L儲存液);
3. 苯jia基磺酰氟(PMSF)(無水乙醇配制的1mol/L儲存液);
4. 純化的細胞核保存于含0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl,(pH7.4)、5mmol/L MgCl2的溶液中;
5. DNA酶Ⅰ;
6. Tris-HCl(1mol/L儲存液,pH7.4);
7. 懸浮緩沖液(SB):5mmol/L MgCl2、10mmol/L Tris-HCl,pH7.4(含0.1mmol/L苯jia基磺酰氟);
8. Triton X-100;
9. 低速離心機,配有固定角轉子和離心管;


實驗方法:
   所有的試劑置于0—4℃,并且所有操作均在0—4℃完成。
1. 向核懸液中加入Triton X-100使其濃度達到1%(體積分數),孵育30min同時用移液器小心混勻,以免產生氣泡;
2. 1000g離心10min,棄去上清。用懸浮緩沖液小體積重懸提取的核沉淀(如5ml);
3. 用DNA酶Ⅰ(30U/mg DNA)消化細胞核30min;
4. 通過緩慢添加1mol/L硫酸銨溶液來增加鹽濃度,使其最終離子強度達到0.6(0.2mol/L 硫酸銨),加入0.2mol/L硫酸銨使體積達到40ml,然后孵育30min;
5. 1000g離心15min沉淀核基質,棄去上清;
6. 用懸浮緩沖液重懸沉淀,用相差顯微鏡或薄片電鏡檢測獲得的產物;


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