圖一、pH輔助LNP噴霧干燥示意圖

實驗結果

2.1 粉末制備與表征：

本研究采用pH調節(jié)的SFD技術成功制備了mRNA-LNPs吸入性粉末。通過調節(jié)溶液在SFD過程中的pH值，增強了mRNA與LNPs中可電離脂質之間的相互作用，從而保留了封裝結構。制備的粉末呈現(xiàn)出適合吸入的特性，mRNA在SFD后仍然被封裝在LNPs內。

表二、噴霧干燥后LNP重新水花后的理化性質表征

2.2 理化性質分析：

• 粒徑與電位：使用ZetaSizer Nano對重新水合的mRNA-LNPs進行粒徑測定，結果顯示，盡管SFD后mRNA-LNPs的粒徑有所增加，但仍在可接受的范圍內（約100-150nm），且未觀察到明顯聚集。Zeta電位測定也證實了粉末的穩(wěn)定性。

• 封裝效率與mRNA完整性：通過電泳分析評估了mRNA的完整性，結果顯示，在pH 3和5條件下進行SFD時，大部分mRNA仍然保留在LNPs內部，且mRNA未發(fā)生降解。同時，測定了mRNA的封裝效率，發(fā)現(xiàn)pH調節(jié)后的SFD方法提高了封裝效率。

• 形態(tài)觀察：使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察了原始液態(tài)和粉末狀mRNA-LNPs的形態(tài)，結果顯示，粉末狀mRNA-LNPs在重新水合后保持了良好的形態(tài)結構。

  
  

  
  

圖二、噴霧干燥后LNP的表征

圖三、噴霧干燥后LNP重新水化的形態(tài)表征

2.3 生物活性評估

• 細胞表達活性：將制備的粉末狀mRNA-LNPs分散在培養(yǎng)基中，并添加到A549和RPMI 2650細胞中，評估其蛋白表達活性。結果顯示，在pH 5條件下制備的粉末狀mRNA-LNPs在兩種細胞中均表現(xiàn)出最高的Luc（熒光素酶）表達水平。此外，ZsGreen1（一種綠色熒光蛋白）的表達也呈現(xiàn)出類似的趨勢。

• 細胞內分布與攝取：使用流式細胞術和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLMS）評估了粉末狀mRNA-LNPs在細胞內的分布和攝取情況。結果顯示，盡管在pH 5條件下制備的粉末狀mRNA-LNPs的細胞內攝取量不是最高的，但其蛋白表達水平卻是最高的。這表明，pH調節(jié)可能增強了mRNA向LNPs的封裝效率，而不是直接促進了細胞內攝取。

• 長期儲存穩(wěn)定性：評估了粉末狀mRNA-LNPs在長期儲存后的穩(wěn)定性。結果顯示，在pH 5條件下制備的粉末狀mRNA-LNPs在儲存105天后仍然保持了較高的蛋白表達水平，而未進行pH調節(jié)的粉末狀mRNA-LNPs在儲存105天后蛋白表達水平幾乎無法檢測到。此外，與原始液態(tài)mRNA-LNPs相比，粉末狀mRNA-LNPs在儲存62天后表現(xiàn)出更高的mRNA轉染效率。

• 氣管內給藥效果：將粉末狀和液態(tài)mRNA-LNPs氣管內給予小鼠，并評估了其在肺部的蛋白表達水平。結果顯示，與液態(tài)mRNA-LNPs相比，粉末狀mRNA-LNPs在小鼠肺部表現(xiàn)出較低的蛋白表達水平，但仍然具有顯著的生物活性。這表明，粉末狀mRNA-LNPs可能適用于吸入性給藥。
  

圖五、噴霧干燥后LNP的體外表達表征

圖六、噴霧干燥后LNP的穩(wěn)定性表征

結論

參考文獻：Ogawa, Koki, et al. "Stable and inhalable powder formulation of mRNA-LNPs using pH-modified spray-freeze drying." International Journal of Pharmaceutics 665 (2024): 124632.