背景與挑戰(zhàn)

1.1 神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療需求：

神經(jīng)系統(tǒng)疾病是全球致殘的首要原因，也是第二大死亡原因。其中，中風(fēng)和癡呆（包括阿爾茨海默病）是主要的致死原因之一。近年來，核酸療法（如mRNA蛋白替代療法或基因編輯療法）開始被探索用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。例如，有研究使用血紅素加氧酶1（HO1）自復(fù)制mRNA治療缺血性中風(fēng)，以及使用腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）mRNA治療阿爾茨海默病。

1.2 血腦屏障的限制：

血腦屏障（BBB）是大腦的天然保護(hù)屏障，由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞組成。BBB阻止了約98%的小分子藥物和幾乎100%的大分子藥物進(jìn)入大腦。因此，LNP必須穿越這一高度選擇性的屏障才能到達(dá)大腦。然而，目前缺乏高效遞送載體的原因之一是缺乏信息豐富的體外篩選平臺。

圖示靜脈給藥后LNP-RNA的體內(nèi)分布

高通量篩選平臺的開發(fā)

2.1 HTS-BBB平臺的構(gòu)建：

為了解決上述問題，Mike Mitchell Lab開發(fā)了一個(gè)用于高通量篩選mRNA LNP的血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)模型（HTS-BBB）。該模型建立在96孔Transwell板上，每個(gè)孔由生長在半透膜上的腦內(nèi)皮單層組成，將頂室（代表血液側(cè)）和基底外側(cè)室（代表腦側(cè)）分開。這種設(shè)計(jì)允許同時(shí)評估LNP的轉(zhuǎn)染效率和跨單層的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。

圖1：血腦屏障（BBB）的生理學(xué)示意圖，以及高通量篩選血腦屏障平臺（HTS-BBB）的開發(fā)，該平臺用于識別能夠穿越并轉(zhuǎn)染血腦屏障、適用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的mRNA脂質(zhì)納米顆粒（mRNA LNPs）。

2.2 優(yōu)化腦內(nèi)皮單層細(xì)胞生長條件：

研究人員選擇了永生化人微血管腦內(nèi)皮細(xì)胞（hCMEC/D3）作為細(xì)胞系，因?yàn)樗鼈冊?型膠原蛋白（BBB基底膜的關(guān)鍵成分）上生長時(shí)，能夠形成具有接觸抑制特性的單層細(xì)胞，并表達(dá)緊密連接和粘附連接，從而有助于調(diào)節(jié)BBB的結(jié)構(gòu)完整性和滲透性。例如，在96孔Transwell板上，hCMEC/D3細(xì)胞以30000 cells/cm2的密度接種，6天后形成完整的單層。研究人員通過活/死成像技術(shù)監(jiān)測細(xì)胞生長情況，并使用共聚焦顯微鏡分析單層的完整性。此外，研究人員還檢測了單層對FITC-葡聚糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，結(jié)果顯示10 kDa和70 kDa的FITC-葡聚糖的轉(zhuǎn)運(yùn)率分別為5%和2%，表明單層具有高度的結(jié)構(gòu)完整性和選擇性通透性。

2.3 優(yōu)化轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)運(yùn)報(bào)告系統(tǒng)：

為了同時(shí)評估LNP的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)運(yùn)效率，研究人員制備了含有熒光素酶（Luciferase）mRNA的LNP，并添加了1%的親脂性染料DiR。熒光素酶mRNA用于評估LNP的轉(zhuǎn)染效率，而DiR用于追蹤LNP的轉(zhuǎn)運(yùn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Luciferase的發(fā)光信號比mCherry熒光信號更為靈敏。研究人員還發(fā)現(xiàn)，DiR的摩爾比對LNP的轉(zhuǎn)染能力有顯著影響，1%的DiR摩爾比是最核實(shí)條件。此外，研究人員還評估了不同處理時(shí)間對轉(zhuǎn)染效率的影響，發(fā)現(xiàn)24小時(shí)的信號強(qiáng)度顯著高于6小時(shí)，表明更長的處理時(shí)間有助于mRNA的翻譯。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與驗(yàn)證

為了驗(yàn)證HTS-BBB平臺的預(yù)測性，研究人員將篩選出的LNP包封Luc-mRNA，按照0.3 mg/kg mRNA劑量靜脈注射到小鼠體內(nèi)。檢測結(jié)果顯示，LNP4和LNP10在大腦中的熒光信號最高，其中LNP4的熒光信號強(qiáng)度超過LNP3的1000倍。此外，注射LNP4的小鼠大腦熒光強(qiáng)度占總熒光強(qiáng)度的1%，而注射LNP3的小鼠大腦熒光強(qiáng)度僅占0.2%。

研究意義與展望

總結(jié)

參考文獻(xiàn)：Han EL, Padilla MS, Palanki R, Kim D, Mrksich K, Li JJ, Tang S, Yoon IC, Mitchell MJ. Predictive High-Throughput Platform for Dual Screening of mRNA Lipid Nanoparticle Blood-Brain Barrier Transfection and Crossing. Nano Lett. 2024 Feb 7;24(5):1477-1486. doi: 10.1021/acs.nanolett.3c03509. Epub 2024 Jan 23. PMID: 38259198.