脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）作為非病毒核酸遞送系統(tǒng)，在臨床應(yīng)用中展現(xiàn)出巨大潛力。然而，LNPs的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，特別是其如何逃逸內(nèi)體并釋放核酸貨物到細(xì)胞質(zhì)中，仍不被充分闡明清楚。LNPs通常由可離子化脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)（如DSPC）、膽固醇和聚乙二醇（PEG）脂質(zhì)組成。膽固醇在LNPs中扮演多重角色，包括填補(bǔ)粒子間隙、限制LNP-蛋白相互作用和促進(jìn)膜融合等。然而，膽固醇對LNPs細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響尚未得到充分研究。本研究旨在探究脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）中膽固醇成分對其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率的影響。通過開發(fā)一種基于鏈霉親和素-生物素-DNA復(fù)合物和高通量成像技術(shù)的高靈敏度LNP/核酸追蹤平臺，我們發(fā)現(xiàn)高膽固醇含量顯著阻礙了LNPs在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致核酸貨物無法有效釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而降低了遞送效率。這一發(fā)現(xiàn)為優(yōu)化LNP配方以提高基因遞送效率提供了新的視角。實(shí)驗(yàn)方法
抗體與試劑：包括兔抗EEA1抗體（早期內(nèi)體標(biāo)記物）、小鼠抗LAMP2抗體（晚期內(nèi)體/溶酶體標(biāo)記物）、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 555標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗、DOPE-Atto647（用于脂質(zhì)標(biāo)記）、膽固醇、SM102脂質(zhì)、DSPC脂質(zhì)、mPEG-DMG脂質(zhì)等。核酸材料：使用pUC57質(zhì)粒作為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得約1000 bp的線性DNA，并在PCR過程中摻入生物素標(biāo)記的dUTP，用于后續(xù)與鏈霉親和素-FITC復(fù)合物結(jié)合進(jìn)行熒光標(biāo)記。成像平臺：使用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)獲取細(xì)胞圖像，通過多層掃描（間隔1 µm）確保覆蓋細(xì)胞深度。成像時(shí)，可分別觀察脂質(zhì)（DOPE-Atto647標(biāo)記）、DNA（鏈霉親和素-FITC標(biāo)記）以及特定細(xì)胞器（EEA1和LAMP2標(biāo)記）的熒光信號。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 LNPs重定向核酸細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)：
使用線性DNA作為模型核酸貨物，通過免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，LNP封裝顯著改變了核酸的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)路徑。具體而言，與裸DNA相比，LNP/DNA復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)不同的分布模式。裸DNA主要滯留在早期內(nèi)體中，其熒光信號與內(nèi)體標(biāo)記物EEA1共定位。而LNP/DNA復(fù)合物則在接種后迅速進(jìn)入細(xì)胞，并在核周區(qū)域聚集，形成所謂的“溶酶體云"。這表明LNP封裝不僅促進(jìn)了核酸的細(xì)胞攝取，還重定向了其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)路徑，使其更接近釋放區(qū)域。Fig. 1. LNPs re-route nucleic acid intracellular trafficking.2.2 高膽固醇含量導(dǎo)致外周LNP-內(nèi)體聚集：
通過設(shè)計(jì)一系列具有不同膽固醇含量的LNP配方，并觀察其在HeLa細(xì)胞中的分布，我們發(fā)現(xiàn)高膽固醇含量顯著影響了LNPs的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。具體而言，當(dāng)膽固醇含量從基準(zhǔn)處方的38.5%摩爾比增加到45%時(shí)，內(nèi)體聚集現(xiàn)象明顯加劇；增加到50%時(shí)，形成大量微米級聚集體。隨著膽固醇含量的增加，外周LNP-內(nèi)體的數(shù)量和大小均顯著增加。這些外周LNP-內(nèi)體主要位于細(xì)胞核上方，且熒光信號強(qiáng)度隨膽固醇含量的增加而增強(qiáng)。進(jìn)一步的分析表明，高膽固醇含量導(dǎo)致LNPs在細(xì)胞內(nèi)的滯留時(shí)間延長，轉(zhuǎn)染效率顯著下降。這些結(jié)果表明，高膽固醇含量阻礙了LNPs向釋放區(qū)域的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低了核酸貨物的遞送效率。Fig. 2. Cholesterol aggravates formation and fusion of peripheral LNP-endosomes.2.3 DSPC緩解膽固醇誘導(dǎo)的外周LNP-內(nèi)體聚集：
為了探究如何緩解膽固醇對LNPs細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的阻礙作用，我們進(jìn)一步研究了輔助脂質(zhì)DSPC的影響。通過設(shè)計(jì)一系列具有不同DSPC含量的LNP配方，并觀察其在HeLa細(xì)胞中的分布，我們發(fā)現(xiàn)DSPC能夠顯著緩解膽固醇誘導(dǎo)的外周LNP-內(nèi)體聚集。隨著DSPC濃度的增加（如從基準(zhǔn)處方的10%摩爾比增加到20%、30%等），膽固醇誘導(dǎo)的內(nèi)體形成得到顯著緩解。外周LNP-內(nèi)體的數(shù)量和大小均有所減少，且LNPs的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)染效率得到提高。這些結(jié)果表明，DSPC作為輔助脂質(zhì)，在LNPs的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮了重要作用，能夠緩解膽固醇的負(fù)面效應(yīng)。Fig. 3. DSPC alleviates formation of peripheral LNP-endosomes induced by cholesterol.討論
本研究新發(fā)現(xiàn)揭示了膽固醇對LNPs細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的阻礙作用。高膽固醇含量導(dǎo)致外周LNP-內(nèi)體聚集，阻礙了LNPs向釋放區(qū)域的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低了核酸貨物的遞送效率。DSPC作為輔助脂質(zhì)，能夠緩解膽固醇的負(fù)面效應(yīng)，提高LNPs的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)染效率。這些發(fā)現(xiàn)為優(yōu)化LNP配方以提高基因遞送效率提供了新的策略。
結(jié)論
本研究表明，膽固醇是LNPs細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要調(diào)節(jié)因子。通過優(yōu)化LNP配方中的膽固醇和DSPC比例，可以提高LNPs的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率和基因遞送效率。未來的研究應(yīng)進(jìn)一步探討膽固醇在LNPs中的作用機(jī)制，以及如何通過調(diào)整LNP配方來實(shí)現(xiàn)最佳遞送效率。
參考文獻(xiàn)：Luo, Chengzhi, et al. "Intracellular trafficking of lipid nanoparticles is hindered by cholesterol." International Journal of Pharmaceutics 671 (2025): 125240.
