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）試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

2）實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

3）不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

4）使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5）使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜； 2.次日洗滌3次； 3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌； 4.（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml； 5.37℃孵育35-60分鐘，洗滌； 6.’最后一遍用DDW洗滌。 其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6

雙抗體夾心法 1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。 2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。 3.　加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。 4.　加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。 5.　終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。 6.　結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性

做好對照

正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

一、ELISA實驗通用規則

1、要保證移液槍的準確性，誤差不能超過2%。可用水和電子天平進行確定。但最好有專業人員進行矯正。

2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標準品時。

3、要在實驗前1小時將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復到室溫，以使結果更穩定。

4、實驗時，要使底物避光保存。

5、用槍吸取液體時速度不能太快，以免產生氣泡而使吸取量不準確。

6、吸取液體時，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。

7、將液體加到酶標孔中時，避免槍頭和孔內液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會自然流下去。

8、液體全部加完后，可將酶標板在桌子上平行輕輕晃動30秒，混勻液體。也可以用酶標儀的晃動功能。

9、溫浴時，要用不干膠或膠帶紙封好酶標板，防止水分的蒸發。

10、洗板時，每次洗液加入后，應靜置1分鐘，使清洗更加*。沒有洗板機時，倒去液體后，要將酶標板在報紙或毛紙上用力拍干。

11、洗液不夠時，可用蒸餾水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸緩沖液，加入0.1%的吐溫20作為洗液。加入1/1000的疊氮鈉后可長期保存。

12、底物是光敏感的，要在臨用前現配。

13、檢測前，要打開酶標儀，使之穩定10分鐘以上。

14、底物有一定的毒性，終止液對皮膚有腐蝕性，應盡量避免接觸。

15、待檢樣品要澄清，否則會影響結果。

16、溫浴時間應遵守試劑盒規定。

17、應盡量做雙孔實驗，這樣才能保證數據的準確性。

18、對結果有疑問的樣品要用其它方法進行確證