細胞色素b5（Cytochrome b5）含量測定試劑盒說明書
微量法 100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
細胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。細胞色素P450和細胞色素b5是P450酶系的兩個血紅素蛋白，其比值的變化與P450代謝活性密切相關。
測定原理：
氧化型細胞色素b5經連二亞硫酸鈉還原后，在424nm處有最大吸收峰，通過測定424nm和490nm處吸光值的差異，即可計算出細胞色素b5的含量。
自備儀器和用品：
普通離心機，超速離心機、可調式移液槍、紫外分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：粉劑×2瓶，4℃保存。臨用前各加100mL蒸餾水，充分溶解。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。
工作液配制：臨用前配制，戴一次性手套，小心打開試劑三瓶蓋，加試劑二20mL充分溶解，4℃避光可保存1周。
樣品中細胞色素b5提取：
1、除去細胞核，線粒體等大分子物質：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液，轉入超速離心管中。
2、粗制微粒體：100 000g，4℃離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、待測液：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即待測液，該待測液需當天測定。
細胞色素b5含量測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min。
2. 工作液置于25℃水浴中預熱30 min。
3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入10 μL蒸餾水，200μL工作液，室溫靜置2 min，424nm和490nm處吸光值，424nm處吸光值記為A空白管1，490nm處吸光值記為A空白管2。△A空白管= A空白管1- A空白管2
4. 測定管：取1mL玻璃比色皿，加入10 μL待測液，200μL工作液，室溫靜置2 min，424nm和490nm處吸光值，424nm處吸光值記為A測定管1，490nm處吸光值記為A測定管2。
△A測定管= A測定管1- A測定管2。
注意：只需要做一個空白管。
樣品細胞色素b5含量計算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
細胞色素b5含量(nmol/mg prot) = (△A測定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總÷（Cpr×V樣）
= 122.8×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr
（2）按樣本質量計算
細胞色素b5含量（nmol/g 鮮重）= (△A測定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總×（V樣總÷V樣）÷W
= 61.4×(△A測定管-△A空白管)÷W
ε：還原型細胞色素b5納摩爾消光系數，171×10-6 L/nmol/cm；d：比色皿光徑（cm），1cm； V反總：反應體系總體積，210 μL =2.1×10-4 L；Cpr：待測液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定；V樣：加入反應體系中待測液體積，10 μL=0.01 mL；V樣總：待測液總體積，0.5 mL；W：樣品質量（g）。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
細胞色素b5含量(nmol/mg prot) = (△A測定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總÷（Cpr×V樣）
= 245.6×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr
（2）按樣本質量計算
細胞色素b5含量（nmol/g 鮮重）= (△A測定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總×（V樣總÷V樣）÷W
= 122.8×(△A測定管-△A空白管)÷W
ε：還原型細胞色素b5納摩爾消光系數，171×10-6 L/nmol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5cm； V反總：反應體系總體積，210 μL =2.1×10-4 L；Cpr：待測液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定；V樣：加入反應體系中待測液體積，10 μL=0.01 mL；V樣總：待測液總體積，0.5 mL；W：樣品質量（g）。
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