維生素B6（Vitamin B6，VB6）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
維生素B6（Vitamin B6）又稱吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在體內以磷酸酯的形式存在，是一種水溶性維生：素，在細胞中參與多種蛋白質和氨基酸的代謝，對生物體具有極其重要的作用。
測定原理：
VB6與4-氨基安替比林在強氧化劑作用下生成穩(wěn)定的黃色化合物，在390nm有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器：
天平、研缽、離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。
試劑組成和配制 ：
提取液：液體70mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體1mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體5mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體8mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑四：液體8mL×1瓶，4℃避光保存。
樣本處理：
1. 組織：將樣品磨碎，按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測定（動物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30分鐘）。
2. 細胞：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入0.6mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測定。
3. 血清：直接測定。
測定操作：
空白管 | 測定管 | |
樣品（μL） | 40 | |
試劑一（μL） | 40 | |
試劑二（μL） | 40 | 40 |
試劑三（μL） | 60 | 60 |
試劑四（μL） | 60 | 60 |
充分混勻，25℃反應20min，于微量石英比色皿/96孔板，測定390nm處吸光值，記為A空白管和A測定管，△A=A測定管-A空白管。空白管只要做一管。 | ||
計算公式：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線：y = 0.3635x+0.0205，R2 = 0.9986
1. 按照蛋白含量計算
VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷（V樣×Cpr）
= 13.76×（△A - 0.0205）÷ Cpr
2. 按照樣本質量計算
VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷（V樣×W÷V樣總）
= 13.76×（△A - 0.0205）÷ W
3. 按照細胞數量計算
VB6含量（μg/104 cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）
= 13.76×（△A - 0.0205）÷ 細胞數量
4. 按照液體體積計算
VB6含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反總÷V樣
= 13.76×（△A - 0.0205）
V反總：反應總體積，0.2mL；：V樣：加入樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL； Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g
b．用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線：y = 0.1818x+0.0205，R2 = 0.9986
1. 按照蛋白含量計算
VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反總÷（V樣×Cpr）
= 27.52×（△A - 0.0205）÷ Cpr
2. 按照樣本質量計算
VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818 ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）
= 27.52×（△A - 0.0205）÷ W
3. 按照細胞數量計算
VB6含量（μg/104 cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）
= 27.52×（△A - 0.0205）÷ 細胞數量
4. 按照液體體積計算
VB6含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反總÷V樣
=27.52×（△A - 0.0205）
V反總：反應總體積，0.2mL；：V樣：加入樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL； Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g
注意事項
1. 若測定結果中吸光值超過1，請將樣本稀釋后進行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數。
2. 蛋白濃度較高的樣品，比如動物組織，若顯色完成后有沉淀產生，將樣本稀釋后再測定，在計算公式中乘以稀釋倍數。
3. 顯色完成后立即進行測定。
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