多功能氧化酶（(mixed function oxidase，MFO）試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
多功能氧化酶又稱混合功能氧化酶，可產生降解反應，可使原化學物質變?yōu)榈投镜幕驘o毒的物質從體內排出；還可產生激活反應，可使原化學物質轉化為具有親電子性質，導致毒性增強，成為致突變物或終致癌物。近年來對混合功能氧化酶系與外源性化學物質相互作用的深入研究，對于從分子生物學水平上進一步了解外源性化學物質的毒作用具有重要意義。
測定原理：
MFO催化對硝基苯甲醚產生對硝基苯酚，在400nm下有特征吸光值。
自備用品：
酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96孔板、研缽、冰、蒸餾水、氯仿。
試劑組成和配制：
提取液：液體120mL×1瓶，4℃保存;
試劑一：液體24mL×1瓶，4℃避光保存;
試劑二：粉劑×3管，-20℃保存；臨用前取一管加入1.5mL水溶解，現配現用。
試劑三：液體24mL×1瓶，4℃保存;
試劑四：液體64mL×1瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
按照組織質量（g）：提取液（mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1、 酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至400nm。
2、在EP管中依次加入如下試劑
試劑名稱（μL） | 測定 | 空白 |
試劑一 | 200 | 200 |
試劑二 | 40 | 40 |
提取液 | 160 | 360 |
樣本 | 200 | |
混勻，37℃水浴30min | ||
試劑三 | 200 | 200 |
分別加入1000μL氯仿，充分混勻萃取，靜置10min，取下層氯仿層0.6mL至新的EP管中。再加入試劑四0.6mL，充分混勻萃取，取上層水相0.2mL于96孔板中，400nm下測定吸光值A測定與A空白，△A=A測
定-A空白。空白管只需測一管。
MFO活性計算:
標準曲線：y = 0.0119x + 0.0021，R2 = 0.9997；y，吸光度；x,標準品濃度，單位nmol/mL。
（1）按樣本質量計算
單位定義：每g樣本每分鐘產生1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
MFO（nmol/min/g 鮮重）=（△A-0.0021）÷0.0119×V總÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=8.4×（△A-0.0021）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1nmol對硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
MFO（nmol/min/mg prot）=（△A-0.0021）÷0.0119×V總÷(V樣×Cpr)÷T
=8.4×（△A-0.0021）÷Cpr
V總：最終萃取液體積，0.6 mL；V樣：反應中樣品體積，200μL；T：反應時間，30min；W：樣品質量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL。
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