Pure 制備色譜
在微生物次級代謝產物中的應用
Pure 應用
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簡介
反向柱層析法（Reverse Phase Column Chromatography, RPCC）是天然產物分離的重要手段之一，其核心作用是通過極性差異實現復雜混合物中目標成分的純化，固定相為非極性（C18、C8 鍵合硅膠），流動相為極性溶劑（水、甲醇、乙腈等）。極性越弱的成分與固定相作用越強，洗脫越慢，從而實現分離。
本實驗通過制備型快速柱層析技術將正相柱層析組分按照極性大小洗脫，流動相為甲醇、水，極性大的組分先被洗脫下來，極性小的組分后被洗脫下來，將洗脫下來的組分減壓旋干稱重，利用高效液相色譜查看分離效果。
▲ 圖1：Buchi Pure C-810 純化分離系統
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實驗
2.1 設備
Buchi Pure C-810 純化分離系統
BUCHI Rotavapor R-300
真空恒溫干燥箱
保干器
高效液相色譜
2.2 試劑及耗材
色譜柱 4g
1mL 一次性塑料注射器
500mL 圓底燒瓶
研缽
試劑（分析純）: 甲醇、水
2.3 樣品和準備工作
樣品：正相柱層析的組分 G-12
將 G-12 保干后稱重得質量 m=2.5775g，將該組分全部溶于甲醇（分析級）后倒入研缽中，加入該組分質量 0.8 倍的 C-18 填料拌樣，拌干后裝入柱子中，又下至上按照 C-18 硅膠、樣品、保護硅膠填滿整根柱子。
2.4 實驗過程
極性組分分離過程包括快速分離制備色譜柱的活化、極性組分的分離、濃縮和稱重。
2.4.1 色譜柱的活化
取一支色譜柱 4g 安裝在 Pure C-810 上，連接好溶劑、管路， 按照 表1 參數平衡色譜柱，充分活化。
表 1：色譜柱平衡參數
Equilibration time | 10min | |
Flow rate | 15mL/min | |
Methanol % | 20 | |
Water % | 80 | |
表 2：極性組分分離參數及洗脫梯度
參數表 | ||
Solvent A | Methanol | |
Solvent B | Water | |
Flow rate | 15mL/min | |
UV length 1 | 254nm | |
UV length 2 | 210nm | |
UV length 3 | 280nm | |
UV length 4 | 320nm | |
UV sensitivity | low | |
UV threshold | 0.05AU | |
Collection | No Collection | |
梯度表 | ||
Time/min | Solvent | %2nd |
0 | AB | 80 |
25 | AB | 80 |
0 | AB | 60 |
35 | AB | 60 |
0 | AB | 40 |
50 | AB | 40 |
0 | AB | 30 |
80 | AB | 30 |
0 | AB | 20 |
70 | AB | 20 |
0 | AB | 10 |
54 | AB | 10 |
0 | AB | 0 |
60 | AB | 0 |
2.4.2 極性組分的收集與濃縮
以 500mL 收集瓶為收集容器外置在一側，從洗脫開始收集洗脫液。如 圖2 所示：
▲ 圖2：安裝色譜柱，極性組分洗脫液的收集及操作界面
取干凈的 500mL 圓底燒瓶烘干，根據色譜分離圖譜將收集到的極性洗脫液轉入燒瓶中，旋蒸除去溶劑，將樣品轉移至西林瓶中，按照相同步驟收集濃縮相應極性組分，將所有組分吹干后放入保干器中干燥24h后稱重。實驗進行過程中，通過紫外檢測器我們可以觀察到樣品的出峰情況，可以根據此情況調整洗脫時間，盡可能的提高效率。
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結果
3.1 G-12 的極性組分分離圖譜
▲ 圖 3：G-12 極性組分分離圖譜
3.2 G-12 極性組分含量
樣品名稱 | m [mg] | |
G-12-1 | 1211.8 | |
G-12-2 | 108.8 | |
G-12-3 | 196.3 | |
G-12-4 | 248.0 | |
G-12-5 | 380.3 | |
G-12-6 | 139.8 | |
G-12-7 | 42.1 | |
各極性組分質量和與 G-12 樣品質量相比并未有太大差距，證明利用此法樣品損耗量小。
3.3 分離效果高效液相色譜驗證
將濃縮后的組分溶于適量色譜甲醇中，高效液相色譜分析條件為 20-95 甲醇 25min，100甲醇 10min，分離效果如 圖5 所示，結果表明各極性組分分離效果良好，并且將前 5min 的大峰單獨分離出來后，后 20min 的小峰均顯現出來，有助于分離單體化合物。
圖 5：極性組分高效液相色譜圖
▲ G-12 組分分析圖
▲ G-12-1 組分分析圖（20%甲醇）
▲ G-12-2 組分分析圖（40%甲醇）
▲ G-12-3 組分分析圖（60%甲醇）
▲ G-12-4 組分分析圖（70%甲醇）
▲ G-12-5 組分分析圖（80%甲醇）
▲ G-12-6 組分分析圖（90%甲醇）
▲ G-12-7 組分分析圖（100%甲醇）
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結論
本應用用 BUCHI 制備型色譜儀 Pure C-810 對微生物次級代謝產物正相柱層析組分按極性進行分離，分離色譜圖表明該組分分離效果良好，組分損耗較少，且通過高效液相色譜驗證，許多原本看不到的小峰在進行砍段后可以顯現，證明此法的可行性。
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參考文獻
Operation manual of Pure C-810
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