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基因敲除原理 我們是利用CRISPR/Cas9基因敲除系統，CRISPR是一種來源于細菌免疫系統的基因編輯技術，能精確識別靶細胞DNA片段中靶點的核苷酸序列，利用核酸內切酶蛋白對DNA靶點序列進行切割，產生雙鏈DNA斷裂，斷裂將在體內被細胞修復機制修復，其中，非同源末端連接NHEJ這種修復將產生短的核酸插入或刪除，其帶來的基因移碼突變，將導致提前出現終止密碼子，從而完成對靶細胞DNA目的基因片段的敲除。在PAM片段上游設計sgRNA后，通過構建基因敲除載體，結合慢病毒系統，可以實現外源基因的整合，利用抗生素或熒光，最終篩選出成功實現基因敲除的細胞。 CRISPR/Cas9基因敲除系統服務優勢： （1）廣泛適用于哺乳動物細胞，脫靶率更低 （2）提高轉染率，減低細胞毒性，縮短實驗周期 基因敲除細胞株的項目流程： （1）項目評估（免費） （2）細胞抗生素敏感濃度摸索與單克隆形成驗證 （3）sgRNA設計與敲除載體構建 （4）慢病毒包裝與轉染 （5）陽性多克隆篩選 （6）陽性單克隆篩選 （7）敲除驗證 基因敲除服務周期：根據細胞生長特性與基因不同，服務周期在5～10周不等。 服務流程： 客戶提供：靶細胞及其培養方案、基因名稱 交付標準：1×基因敲除陽性單克隆細胞株（復蘇） 1×項目結題報告 服務保證： （1）項目啟動后，密切跟進實驗進展，每兩周進行一次項目進度匯報。 （2）項目結題報告包含sgRNA序列、實驗詳細記錄、測序結果及分析等，滿足客戶后期論證材料需求。 （3）基因敲除陽性單克隆均經過靶標片段T載體克隆測序驗證，保證基因敲除。 【案例分享】CRISPR/Cas9基因敲除細胞株構建 1 抗生素敏感濃度摸索?? 將細胞如下圖1稀釋。給藥7天后，棄培養液，用臺盼藍染色2 min，顯微鏡下觀察細胞存活情況。確定細胞多克隆細胞篩選和單克隆細胞篩選濃度。 圖1 抗性濃度摸索 2 單克隆形成驗證 細胞計數，將細胞懸液稀釋混勻后加入96孔板，用封口膠將孔板封好，放于培養箱中培養。靜置培養48 h后每日觀察并記錄單克隆形成情況。 3 靶標基因sgRNA 設計 根據基因序列信息，設計 sgRNA。 4 位點序列信息確認 PCR擴增（圖2），測序驗證基因序列，以確定sgRNA區域有無SNP。 圖2 靶標序列擴增 5 敲除載體構建 退火，連接，轉化，涂板（LB/Amp）培養。 每個實驗組各挑取6個單克隆菌落，于LB/ Amp培養基中擴增，提取質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒提取效果（圖3）。 圖3 質粒抽提 酶切驗證 ：取3個單克隆酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果（圖4）。選擇2個樣品送樣測序。 圖4 單克隆酶切驗證 6 慢病毒包裝 敲除載體無內毒素質粒提取，病毒包裝。 7 細胞轉染 配制梯度病毒稀釋液，細胞于培養箱中靜置培養48h。 8 陽性多克隆細胞株篩選 9 陽性單克隆細胞株篩選 細胞轉染48h后，更換培養基，篩選至對照組大部分細胞死亡，實驗組細胞擴大培養，進行單克隆篩選。幾天后挑選陽性單克隆進行擴增，并取樣驗證。 10 陽性單克隆細胞株驗證 1、測序驗證 提取陽性單克隆細胞株的基因組，將靶標基因酶切克隆至T載體后測序，以確定是否敲除成功。 實驗結果示例： 該基因有兩個單克隆細胞株，A1和A2。 單克隆細胞A1的目的基因在sgRNA2位置出現兩種突變形式，分別缺失1個和19個堿基，在新序列的第337位和第355位堿基提前出現終止密碼子。 單克隆細胞A2的目的基因在sgRNA2位置發生突變，插入1個堿基，在新序列的第340位堿基提前出現終止密碼子。