1. 細胞準備

- 人多能干細胞（hESCs）分化為SC-islets：

- 使用H1 hESCs，按照七步分化步驟進行分化。

- 在第21天，將細胞用Accutase消化，重新聚集在低附著6孔板中，濃度為3×10?細胞/孔。

- 在第22天，將細胞聚集物轉移到新的低附著6孔板中，并在118 rpm下振蕩培養。

- 繼續培養至第39天，用于后續的共培養實驗。

- 人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）：

- 購自Lonza，使用EGM-2培養基培養。

- 在第2代時，用表達Azurite Blue的慢病毒轉導ECs，用于血管網絡可視化。

- 人肺成纖維細胞（NHLFs）： 購自Lonza，使用FGM-2培養基培養。

2. SC-islets的重聚集

- 將SC-islets用Accutase消化成單細胞，然后以約1000個細胞/微孔的密度接種到BSA包被的微孔平臺（StemFIT 3D）中。

- 允許細胞在微孔中重新聚集至少2天，形成直徑小于200微米的SC-islet簇。

3. 3D血管化SC-islet類器官的組裝

- 制備3D纖維蛋白凝膠：

- 將纖維蛋白原粉末溶解在EBM培養基中，濃度為2 mg/ml。

- 將100個重聚集的SC-islets和2×10?個分離的ECs和FBs（1:1比例）懸浮在100 µl纖維蛋白原溶液中。

- 將細胞混合物與16 µl的50 U/ml凝血酶混合，形成凝膠。

- 凝膠培養：

- 將混合物倒入24孔板中，形成圓形凝膠滴。

- 在37℃下聚合30分鐘。

- 在凝膠上添加不同的共培養培養基（見表S1），維持4-7天。

4. 共培養條件優化

- 培養基調整：

- 測試了不同比例的血管化培養基（VM）和SC-islet培養基（IM）對細胞存活的影響。

- 確定75% VM + 25% IM的混合培養基能夠支持血管網絡的形成，但會降低SC-β細胞的胰島素含量。

- 采用逐步培養基變化（GM1）：從75% VM + 25% IM逐漸過渡到100% IM，以維持胰島素含量。

- 細胞共培養：

- 在3D纖維蛋白凝膠中，將SC-islets與ECs和FBs共培養。

- 在GM1條件下培養5天，觀察到ECs和FBs能夠形成完整的血管網絡，且SC-islets保持胰島素含量。

5. 微流控設備中的血管化SC-islet類器官

- 設備制備：（略）

- 小編推薦使用成熟商品化的Kirkstall Quasi Vivo多細胞共培養微流控設備，通道通過組織室連接。

- 細胞加載：

- 將纖維蛋白原溶液（5 mg/ml）與0.15 U/ml抑肽酶和0.2 mg/ml纖維連接蛋白混合。

- 將100-130個SC-islets、35×103個ECs和FBs（1:1比例）懸浮在5 µl纖維蛋白原-纖維連接蛋白溶液中，與1.2 µl的50 U/ml凝血酶混合后，加載到組織室中。

- 在37℃下孵育10分鐘，然后用纖維連接蛋白涂覆上下通道，再孵育15分鐘。

- 血管形成與培養：

- 在組織室中添加培養基，通過交替改變四個儲液池中的培養基體積，誘導血管形成和與通道的吻合。

- 在第5天，使用70 kDa熒光素-葡聚糖測試血管的通透性。

- 在微流控設備中維持共培養長達7天，使用表S2中的培養條件。

6. 功能驗證

- Ca2?成像：

- 使用GCaMP6f-hESCs生成的SC-islets，通過活細胞染色和免疫熒光染色，監測SC-β細胞的Ca2?信號。

- 在低葡萄糖（2.8 mM）、高葡萄糖（16.8 mM）和Exendin-4（10 nM）刺激下，記錄Ca2?信號。

- 胰島素分泌檢測：

- 使用Biorep灌流系統進行動態胰島素分泌檢測。

- 測量不同刺激條件下的C肽含量，評估胰島素分泌功能。

7. 單細胞RNA測序分析

- 對SC-islets和微流控設備中的ECs和FBs進行單細胞RNA測序。

- 使用CellChat分析細胞間通信網絡，預測ECs和SC-β細胞之間的信號通路，如BMP4信號。

通過以上步驟， Maike Sander et al.成功構建了血管化的三維SC-islet類器官模型，并驗證了其在模擬胰島功能和疾病模型中的潛力。

附：微流控設備中血管形成的具體操作步驟如下：

（1）. 微流控芯片的設計與制備（略）

- 小編推薦使用成熟商品化的Kirkstall Quasi Vivo 動態3D活細胞自動化微流控設備

（2）. 基質膠的制備與灌注

- 基質膠預處理：將基質膠預聚液放置于4°C冰上過夜，使其充分融化。同時將移液器、吸頭和微流控芯片提前預冷。

- 灌注基質膠：將融化的基質膠與無血清DMEM培養基按1:1比例混合，用預冷的移液器吸取10μL混合液，從微流控芯片中間通道的入口處輕輕注入。

- 凝膠形成：將灌注好的微流控芯片放置于37°C培養箱中孵育30分鐘，使基質膠充分聚合形成凝膠。

（3）. 細胞接種與培養

- 細胞懸液制備：制備高密度的臍靜脈內皮細胞（HUVECs）懸液，濃度為10?個/mL，與基質膠預聚液按1:1（v/v）混勻。

- 細胞接種：將HUVEC-Matrigel混合懸液注入微流控芯片的中間通道，置于37°C孵箱中孵育30分鐘，形成包埋有細胞的基質膠網絡。

- 培養基添加：在兩側通道中加入含有促血管生長因子（如VEGF、bFGF和EGF各10ng/mL）的DMEM培養基，為細胞生長提供營養。

（4）. 血管生成與觀察

- 細胞活性檢測：培養3天后，使用鈣黃綠素和碘化丙啶進行雙染，考察細胞活性狀態。

- 細胞遷移與管樣結構形成：在促血管生長因子濃度梯度的誘導下，觀察內皮細胞的遷移和管樣結構形成情況。每隔12小時換液一次，維持濃度梯度。

- 成像與分析：利用相差顯微鏡或熒光顯微鏡觀察細胞的遷移和管樣結構形成情況，使用ImageJ軟件計算細胞的最長遷移距離和遷移面積。

（5）. 內皮細胞內襯與管腔形成

- 內皮細胞內襯：在微流控通道中，用層粘連蛋白包被通道，隨后將高濃度的內皮細胞通入，使細胞均勻粘附在管腔壁上。

- 管腔形成：在細胞培養液層流剪切應力的作用下，24小時后，內皮細胞增殖并形成單層，構建模擬靜動脈的大血管的內皮細胞內襯的管腔。

通過上述步驟，可以在微流控設備中成功構建血管網絡，用于模擬體內血管生成過程和相關研究。

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