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通過結(jié)構(gòu)仿生與功能整合,不僅為腸道感染機(jī)制研究提供了動(dòng)態(tài)平臺(tái),還為抗菌藥物(尤其是噬菌體療法)的高通量篩選開辟了新路徑,其核心優(yōu)勢在于三維結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)的組織功能化與快速生理響應(yīng)能力,顯著提升了體外模型與體內(nèi)環(huán)境的一致性。
一、腸道感染建模實(shí)驗(yàn)步驟
1. 模型準(zhǔn)備與細(xì)菌培養(yǎng)
- 組織模型構(gòu)建:將Caco-2與HT29-MTX-E12細(xì)胞按6:1比例接種于V-ECM(絨毛-隱窩仿生界面)、F-ECM(平坦ECM界面),培養(yǎng)72小時(shí)形成完整上皮層。
- 細(xì)菌制備:使用大腸桿菌(E. coli)菌株(如ATCC BAA-2326™或ATCC 11303™),接種于LB瓊脂板37℃培養(yǎng)24小時(shí),收集菌落并調(diào)整菌液濃度至OD???=0.01或0.1。
2. 感染模型建立與動(dòng)態(tài)監(jiān)測
- 感染接種:移除模型培養(yǎng)基,加入含大腸桿菌的培養(yǎng)基,共培養(yǎng)72小時(shí),每24小時(shí)通過熒光顯微鏡觀察細(xì)菌與組織的互作(細(xì)菌用GFP標(biāo)記,細(xì)胞用CM-Dil染色)。
- 覆蓋面積分析:利用ImageJ軟件量化GFP標(biāo)記細(xì)菌在組織表面的覆蓋比例,對比V-ECM與對照組的差異。
- 屏障功能評估:通過電化學(xué)阻抗譜(EIS)測量跨上皮電阻(TEER),感染后TEER值的變化反映組織屏障完整性。V-ECM組在感染后TEER反而升高,而F-ECM組顯著下降。
3. 細(xì)菌定植與侵襲能力檢測
- 菌落計(jì)數(shù)(CFU):收集培養(yǎng)介質(zhì)(浮游菌)和刮取組織表面(黏附菌),梯度稀釋后接種于LB平板,計(jì)算CFU/mL。V-ECM組黏附菌數(shù)量顯著低于對照組。
- 侵襲實(shí)驗(yàn):采用慶大霉素保護(hù)法,感染后用慶大霉素殺死胞外菌,裂解細(xì)胞后培養(yǎng)計(jì)數(shù),評估細(xì)菌侵襲組織的能力。V-ECM組侵襲菌比例僅為0.1%,遠(yuǎn)低于F-ECM的3.7%。
4. 抗菌機(jī)制驗(yàn)證
- 抗菌肽(AMPs)檢測:通過ELISA測定感染后組織分泌的人β-防御素2(HBD2),V-ECM組感染后HBD2分泌量顯著升高。
- 基因表達(dá)分析:RT-PCR檢測AMPs相關(guān)基因(如DEFB4A、DEFB103B)及炎癥因子(IL-1α、TNF),V-ECM組AMPs基因上調(diào),而對照組促炎基因激活。
- 黏膜屏障觀察:Alcian Blue染色顯示V-ECM組黏膜層覆蓋面積達(dá)81.28%,而F-ECM組僅11.32%,黏液層的完整性抑制了細(xì)菌黏附。
二、抗菌藥物篩選實(shí)驗(yàn)步驟
1. 耐藥菌感染模型構(gòu)建
- 耐藥菌制備:將大腸桿菌轉(zhuǎn)化為卡那霉素(Kan)耐藥株(如攜帶mini-Tn7-kan-gfp質(zhì)粒),調(diào)整OD???=0.1用于感染。
- 感染預(yù)處理:V-ECM模型培養(yǎng)72小時(shí)后,接種耐藥菌4小時(shí),隨后更換含藥物的培養(yǎng)基。
2. 藥物處理與效果對比
- 藥物設(shè)置:實(shí)驗(yàn)組分為T4噬菌體組(10? PFU/mL)、Kan組(100 μg/mL)及對照組(無藥)。
- 動(dòng)態(tài)監(jiān)測:每8小時(shí)取樣,熒光顯微鏡觀察細(xì)菌覆蓋面積,CFU計(jì)數(shù)評估細(xì)菌數(shù)量變化。T4噬菌體組24小時(shí)內(nèi)細(xì)菌覆蓋從84%降至接近0,而Kan組無明顯效果。
3. 噬菌體增殖與抗菌機(jī)制分析
- 噬菌斑檢測:收集T4噬菌體處理后的培養(yǎng)基,梯度稀釋后接種于雙層瓊脂,觀察噬菌斑形成。24小時(shí)后噬菌斑數(shù)量增加約100倍,表明噬菌體在感染部位增殖。
- 電鏡觀察:透射電鏡(TEM)顯示T4噬菌體吸附于細(xì)菌表面并導(dǎo)致菌體裂解,而Kan處理組細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)完整。
- 多重感染指數(shù)(MOI):計(jì)算噬菌體與細(xì)菌的比例,T4組MOI在24小時(shí)內(nèi)從1:1升至10?:1,形成“自擴(kuò)增"抗菌效應(yīng)。
三、關(guān)鍵技術(shù)優(yōu)勢與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
1. 模型性能對比
2. 創(chuàng)新點(diǎn)與應(yīng)用價(jià)值
- 快速篩選平臺(tái):24小時(shí)內(nèi)完成抗菌效果評估,較傳統(tǒng)方法(需數(shù)周)大幅縮短周期。
- 仿生機(jī)制模擬:絨毛-隱窩結(jié)構(gòu)促進(jìn)黏液層與AMP協(xié)同作用,更貼近體內(nèi)抗菌機(jī)制。
- 耐藥菌治療潛力:噬菌體在V-ECM模型中可自我擴(kuò)增,為AMR(抗微生物藥物耐藥性)感染提供新策略。
作者將 3D 仿生腸道絨毛模型應(yīng)用于腸道感染建模和抗菌藥物篩選。研究人員以大腸桿菌(E. coli)為模型病原體,比較了該模型與傳統(tǒng) 2D 培養(yǎng)模型在感染過程中的差異。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在仿生界面上培養(yǎng)的類器官能夠有效抵抗大腸桿菌的感染。與對照組相比,其表面的細(xì)菌定植和生物膜形成明顯減少,這主要?dú)w因于類器官分泌的天然抗菌肽(AMPs)水平升高。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明,仿生界面的結(jié)構(gòu)特征促進(jìn)了杯狀細(xì)胞的分化和黏蛋白的分泌,形成了有效的黏膜屏障,從而抑制了病原體的黏附和入侵。
基于該模型的良好性能,研究人員還進(jìn)行了抗菌藥物篩選實(shí)驗(yàn)。他們比較了傳統(tǒng)抗生素卡那霉素和噬菌體 T4 對耐藥大腸桿菌的治療效果。結(jié)果顯示,噬菌體 T4 能夠在 24 小時(shí)內(nèi)顯著降低細(xì)菌數(shù)量,而卡那霉素則由于細(xì)菌耐藥性而效果不佳。這一結(jié)果不僅驗(yàn)證了該模型在抗菌藥物篩選中的實(shí)用性,也為耐藥菌感染的治療提供了新的思路。
四、實(shí)驗(yàn)拓展與未來方向
- 微流控整合:將V-ECM模型接入英國Kirkstall Quasi Vivo器官芯片(OoC),模擬腸道蠕動(dòng)流場,評估動(dòng)態(tài)剪切力對感染與藥物效果的影響。
- 共培養(yǎng)系統(tǒng):構(gòu)建英國Kirkstall Quasi Vivo雙腔器官芯片(OoC),上層腸道組織+下層血管內(nèi)皮細(xì)胞,研究病原體跨屏障侵襲與免疫細(xì)胞互作。
- 原代類器官驗(yàn)證:使用患者來源的腸道類器官(hIOs)接種于V-ECM,提升模型臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。
附:超47億元!國家科技重大專項(xiàng)2025年項(xiàng)目申報(bào)指南發(fā)布(以下摘自2025.6.30“科獎(jiǎng)中心")
Kirkstall Quasi Vivo®類器官串聯(lián)芯片3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)
北 京 基 爾 比 生 物 科 技公司 主 營 產(chǎn) 品:
Kilby 全自動(dòng) 3D-clinostat 細(xì)胞培養(yǎng)儀,
Kilby Gravity 微/超重力三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),
3D回轉(zhuǎn)重力環(huán)境模擬系統(tǒng),隨機(jī)定位儀,
類器官芯片搖擺灌注儀,
Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯(lián)芯片仿生系統(tǒng)
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