NobleRyderD9938  去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒 Free Endotoxin Plasmid Extraction Maxi Kit

去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒 質(zhì)粒提取

產(chǎn)品貨號：D9938

產(chǎn)品名稱：去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒 Free Endotoxin Plasmid Extraction Maxi Kit

英文名稱：Free Endotoxin Plasmid Extraction Maxi Kit

產(chǎn)品規(guī)格：10T

產(chǎn)品簡介：

儲存條件：酶附件-20℃，內(nèi)毒素清除劑4℃，其它試劑RT，復(fù)檢期1年

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

 NobleRyderD9938  去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。 離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物。 Solarbio公司研制的內(nèi)毒素清除劑，可最大限度地除去內(nèi)毒素。從50-100ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中，可快速提取200-300μg高純度高拷貝的質(zhì)粒DNA，提取率達85-90%。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于細胞轉(zhuǎn)染等要求較高的實驗，以及其他各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗。

使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽（每瓶需單獨加入60mL 無水乙醇）。P1在使用前先加入RNase A（將試劑盒中提供的RNase A全部加入），混勻，置于2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

第一次開蓋使用后請將內(nèi)毒素清除試劑于2-8℃保存，可以縮短使用時的冰上預(yù)冷時間。

操作步驟（僅供參考）:

1. 取50-100mL 細菌培養(yǎng)物，11000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。

2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入4mL P1(請先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或旋渦振蕩器che底懸浮細菌細胞沉淀。注意：如菌塊未che底混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。

3. 向離心管中加入4mL P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染細菌基因組 DNA，此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時間不要超過 5min，以免質(zhì)粒被破壞。

4. 向離心管中加入4mL P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。11000rpm 離心10min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5. 加入上清1/5體積的冰上預(yù)冷內(nèi)毒素清除劑，振蕩混勻溶液變渾濁，冰浴5-10min至溶液變清亮。

6. 42℃水浴5min，不時振蕩，溶液又變渾濁，11000rpm室溫離心5min，溶液應(yīng)分為兩相，上層水相含質(zhì)粒DNA，下層油相含內(nèi)毒素。

7. 將含質(zhì)粒DNA的上層水相轉(zhuǎn)移至新管，棄下層油相，注意不要吸入油狀相。重復(fù)抽提三次，即重復(fù)步驟5-7三次。

8. 加入0.5 倍上清體積的無水乙醇，充分混勻后加入吸附柱(吸附柱加入收集管中)，室溫放置2min，11000rpm 離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

9. 向吸附柱中加入7mL漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，11000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

10. 向吸附柱中加入7mL漂洗液，11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

11. 11000rpm 離心 2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗，如酶切、PCR等。

12. 將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加1-2mL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min，11000rpm離心2min。

13. 為增加質(zhì)粒的回收效率，可將洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，11000rpm離心2min。

注意事項：

1. 使用前請先檢查P2和P3是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。P2、P3、漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。

2. 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于500μL，體積過小影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍)，pH 值低于7.0會降低洗脫效率，DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。

3. 如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?10kb 的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用 100-200mL過夜培養(yǎng)物，同時按照比例增加P1、P2和P3的用量，吸附和洗脫時可以適當?shù)难娱L時間，以增加提取效率。

4. DNA 濃度及純度檢測：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。得到的 DNA 可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA 應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當于大約50ug/mL雙鏈DNA、40ug/mL單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為 1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響吸光值，但并不表示純度低。

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