淀粉磷酸化酶（Starch phosphorylase，SP）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

淀粉磷酸化酶（Starch Phosphorylase，SP）是淀粉代謝過(guò)程wei一的可逆反應(yīng)酶，既可催化淀粉的合成，也可催化淀粉的分解。

在高等植物中，淀粉磷酸化酶（合成方向）主要存在于質(zhì)體中，負(fù)責(zé)延長(zhǎng)淀粉的 α-1,4-葡萄糖鏈的非還原末端；淀粉磷酸化酶（分解方向）主要存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，催化淀粉中的α-1,4-糖苷鍵磷酸解產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，負(fù)責(zé)葡萄糖鏈的磷酸解，是淀粉代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶。

在植物體中，淀粉磷酸化酶分解方向的底物無(wú)機(jī)磷濃度比合成方向的底物葡萄糖-1-磷酸濃度幾乎高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，一般認(rèn)為淀粉磷酸化酶只催化淀粉的分解，因此，分解方向的淀粉磷酸化酶具有重要測(cè)定意義。

測(cè)定原理：

淀粉磷酸化酶催化淀粉中的α-1,4-糖苷鍵與無(wú)機(jī)磷反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖變位酶的作用下產(chǎn)生葡萄糖-6-磷酸，并在 6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化下還原 NADP+產(chǎn)生NADPH，使 340nm 下吸光值增加。

淀粉磷酸化酶試劑盒  淀粉系列-常備現(xiàn)貨

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 1.5ml 水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存；試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 1.5ml 水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g， 4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm；

2、工作液的配制：臨用前按照樣本量將試劑一、試劑二、試劑三按照 170μl:10μl:10μl 的比例混合，臨用前配制，半小時(shí)內(nèi)使用。

3、在 96 孔板中加入 10μl 樣本和 190μl 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處 1min 時(shí)的吸光值A1 和 6min時(shí)的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

SP 活力單位的計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SP（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1286×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SP（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=1286×ΔA÷W

（3） 按樣本細(xì)胞計(jì)算

單位定義：每萬(wàn)個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SP（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V 樣÷V 樣總)÷T

=2.572×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑， 0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；細(xì)胞數(shù)量，500 萬(wàn)。

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