谷胱gan肽還原酶（GR）活性測定試劑盒說明書

微量法 100T/96S

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

GR 是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱gan肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一（通常昆蟲中 GR 被TrxR 取代）。GR 催化NADPH 還原GSSG 生成GSH，有助于維持體內(nèi) GSH/GSSG比值。GR 在氧化脅迫反應(yīng)中對活性氧清除起關(guān)鍵作用，此外GR 還參與抗壞血酸－谷胱gan肽循環(huán)途徑。

測定原理：

GR 能催化NADPH 還原GSSG 再生GSH，同時NADPH 脫氫生成NADP⁺；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，相反NADP⁺在該波長無吸收峰；通過測定 340 nm 吸光度下降速率來測定 NADPH 脫氫速率，從而計算GR 活性。

谷胱gan肽還原酶（GR）活性測定試劑盒

組成：

試劑二：粉劑×2 支，-20℃保存。臨用前加入 1.2ml 蒸餾水，混勻。試劑三：粉劑×2 支，-20℃保存。臨用前加入 0.6ml 蒸餾水，混勻。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

自備儀器和用品：

低溫離心機、水浴鍋、移液器、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、和蒸餾水

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 15min，取上清，置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g， 4℃，離心 15min，取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

操作步驟：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一置于 25℃（普通物質(zhì)）或者 37℃（哺乳動物）中預(yù)熱 30min。

3. 測定管：取微量石英比色皿或 96 孔板，依次加入 10μl 試劑三，20μl 試劑二，150μl 試劑一，20μl 上清液，混勻，于 340nm 迅速測定初始吸光度和 180 s 吸光度，記為 A 測 1 和A 測 2，△A 測定管= A 測 1﹣A測 2。

注意：

1、加完上清液后必須迅速混勻測定，保證準確測出初始反應(yīng)速度；

2、當(dāng)出現(xiàn)初始 180s 內(nèi)吸光值不穩(wěn)定時，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間，選取相對穩(wěn)定的時間段內(nèi)吸光值變化值；

3、當(dāng)所測△A 測定管的值在零點附近徘徊時，可能原因：（1）樣本GR 酶活性低，建議濃縮樣本后再進行測定；（2）樣本GR 酶活性過高，吸光值變化區(qū)間過小無法準確測出，建議樣本稀釋 2~5 倍后再進行測定

計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷[Cpr×V 樣]÷T

= 536×△A 測定管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每克樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 536×△A 測定管÷W

(3) 按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每 10⁴ 個細胞每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹] ÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

= 536×△A 測定管÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每毫升液體每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/ml)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷×V 樣÷T

= 536×△A 測定管

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù) 6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，200μl=2×10^-4 L；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/ml）；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μl =2×10^-2 ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，3 min。 b.使用 96 孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷[Cpr×V 樣]÷T

= 1072×△A 測定管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每克樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 1072×△A 測定管÷W

(3) 按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每 10⁴ 個細胞每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹] ÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=1072×△A 測定管÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每毫升液體每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/ml)= [ (△A 測定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷×V 樣÷T

=1072×△A 測定管

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù) 6.22×10³L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，200μl=2×10^-4 L；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/ml）；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μl =2×10^-2 ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，3 min。

注意事項：

（1） 樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當(dāng)日測定酶活力，勻漿液避免反復(fù)凍融；

（2） 試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制完后，置于冰上，未使用完的 4℃保存，三天內(nèi)使用完。

（3） 測定前須先用 1～2 個樣做預(yù)實驗，哺乳動物組織一般須用試劑一稀釋 2～5 倍。

（4） 細胞中 GR 活性測定時，細胞數(shù)目須在 300 萬-500 萬之間，細胞中 GR 的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。

谷胱gan肽還原酶（GR）活性測定試劑盒