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細(xì)胞凋亡是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序死亡過程。在正常活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，細(xì)胞凋亡早期，PS 會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin V 是一種分子量為 35-36kDa 的鈣離子依賴型磷脂結(jié)合蛋白，能與 PS 高親和力特異性結(jié)合。Annexin V-AbFluor™ 405 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒中的 Annexin V 被 AbFluor™ 405 熒光染料標(biāo)記，可通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測早期凋亡細(xì)胞。

碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過完整細(xì)胞膜。早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜保持完整，對 PI 有拒染性；但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI 能透過細(xì)胞膜，使細(xì)胞核染上紅色熒光。將 Annexin V 與 PI 匹配使用，可區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞以及凋亡中晚期或壞死細(xì)胞。

具體來說，使用 Annexin V-AbFluor™ 405 和 PI 染色細(xì)胞群后，在流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡下觀察：活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，Annexin V-AbFluor™ 405 無法與其結(jié)合，幾乎無熒光；早期凋亡細(xì)胞的 PS 外翻，Annexin V-AbFluor™ 405 與其結(jié)合，使細(xì)胞膜呈現(xiàn)藍(lán)色熒光；凋亡中晚期或壞死細(xì)胞，細(xì)胞膜破損，PI 進(jìn)入細(xì)胞與核酸結(jié)合，使細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色熒光，同時(shí)細(xì)胞膜上結(jié)合的 Annexin V-AbFluor™ 405 使其呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。

操作步驟

• 流式細(xì)胞儀分析 ：

1. 通過所需方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)培養(yǎng)無誘導(dǎo)的對照培養(yǎng)物。

2. 4℃，300g 離心 5min 收集 1-2×10^5 細(xì)胞，用冰預(yù)冷的 PBS 洗滌兩次。貼壁細(xì)胞使用胰酶消化后離心收集細(xì)胞，需控制胰酶消化時(shí)間，避免細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷出現(xiàn)細(xì)胞壞死假陽性。

3. 用 100µL 1×Annexin V Binding Buffer 重懸細(xì)胞。

4. 每 100µL 細(xì)胞懸液中加入 4-5µL Annexin V-AbFlour™ 405 和 1-2µL PI，輕柔混勻。

5. 室溫避光孵育 15min。

6. 孵育結(jié)束后加入 400µL 1×Annexin V Binding Buffer，輕柔混勻后置于冰上。染色后 30min 內(nèi)通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞，使用 404nm 和 535nm 激發(fā)，431nm 和 617nm 附近測量熒光。

• 熒光顯微鏡分析 ：

• 懸浮細(xì)胞 ：按流式細(xì)胞分析步驟操作后，將細(xì)胞懸浮置于玻片上，用蓋玻片蓋住細(xì)胞，盡快使用適當(dāng)濾鏡通過熒光顯微鏡分析細(xì)胞。

• 貼壁細(xì)胞 ：

1. 細(xì)胞接種于爬片或腔室載玻片上，培養(yǎng)細(xì)胞。

2. 通過所需方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)培養(yǎng)無誘導(dǎo)的對照培養(yǎng)物。

3. 除去培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌細(xì)胞兩次。

4. 準(zhǔn)備工作液：每 100µL 1×Annexin V Binding Buffer 添加 4-5µL Annexin V-AbFlour™ 405 和 1-2µL PI，輕柔混勻。最佳濃度可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求確定。

5. 在細(xì)胞中加入適量工作液，確保工作液全部覆蓋細(xì)胞，室溫避光孵育 15-30min，也可在冰上孵育，但孵育時(shí)間需延長到至少 30min。

6. 用 1×Annexin V Binding Buffer 洗滌細(xì)胞兩次，此步不要使用 PBS 洗滌細(xì)胞。

7. 載玻片上添加一滴 1×Annexin V Binding Buffer，然后將細(xì)胞爬片置于載玻片上，對于細(xì)胞腔室載玻片上的細(xì)胞，添加足夠 1×Annexin V Binding Buffer 覆蓋細(xì)胞，也可使用抗熒光淬滅封片劑封片。

8. 使用適當(dāng)濾光片在熒光顯微鏡下分析細(xì)胞。

試劑盒組分及儲(chǔ)存

試劑盒包含 Annexin V Binding Buffer（5×）、Annexin V-AbFluor™ 405、Propidium Iodide（PI）。Annexin V Binding Buffer（5×）需按說明用去離子水稀釋成 1×Annexin V Binding Buffer。Annexin V-AbFluor™ 405 和 PI 均為即用型，使用前需平衡到室溫。試劑盒在 4℃避光保存，穩(wěn)定期至少 6 個(gè)月。

技術(shù)參數(shù)

Annexin V-AbFluor™ 405 的激發(fā)波長 / 發(fā)射波長為 404nm/431nm，PI 與 DNA 結(jié)合后的激發(fā)波長 / 發(fā)射波長為 535nm/617nm。