全柱成像毛細管等電聚焦——高分辨質譜聯用技術（iCIEF-MS）分析重組人單克隆抗體

張曉夕

全柱成像毛細管等電聚焦（imaged capillary isoelectric focusing, iCIEF）是一種基于蛋白質等電點（isoelectric point, pI）將其分離的技術，在生物制藥行業中被廣泛應用于電荷變異體的分析。

與傳統的毛細管等電聚焦（CIEF）技術相比，iCIEF具有方法開發更快（每個樣品僅需10~15min），靈敏度更高，pI值相近的電荷變異體分離更好（分離精度0.01pI），儀器平臺穩定性好以及高分析通量等優點。

圖1 iCIEF分離及UV檢測原理

雖然iCIEF平臺可以將常見的生物治療產品，如單抗、融合蛋白等按照其等電點進行分離，但受其檢測手段的局限性，無法得到更為全面深入的蛋白表征信息。2021年6月，賽默飛世爾科技宣布了與Advanced Electrophoresis Solutions Ltd（AES）的合作， 通過將AES的CEInfinite iCIEF平臺與賽默飛的高分辨質譜平臺聯用，對iCIEF分離的電荷變異體進行表征，從而實現對生物治療產品更加深入的理解。

圖2 CEInfinite iCIEF平臺

今年9月，來自丹麥Symphogen 的首席科學家Dan Bach Kristensen在CE Pharm 2021會議上以視頻形式介紹了iCIEF-MS聯用的最新成果。Dan在報告中提到，使用質譜對單克隆抗體進行分子量分析，樣品前處理步驟簡單，且Orbitrap高分辨質譜平臺的高分辨率和高靈敏度等優點可以提供足夠多的信息，幫助科研人員從完整分子量層面對產品進行監控。

通過將不同原理的液相分離技術，如SEC/CIEX/Protein A/RPLC分別與質譜串聯，可以將單克隆抗體的不同類型變異體進行分離，隨后得到各個變異體的分子量信息。

Dan在他的演講中舉了一個使用iCIEF-MS聯用對參比品（-80℃保存）和實驗品（48個月，5℃保存）進行對比的示例。通過觀察iCIEF-UV圖譜，發現相較于參比品，實驗品的酸/堿峰均有一定比例的上升。進一步通過質譜數據確認導致酸/堿峰比例增加的具體修飾類型，發現對于堿峰，Orbitrap高分辨質譜的高分辨率和高靈敏度等優點可以最大限度的減少相鄰質譜峰的重疊，從而提供更加可信的鑒定結果。最終，通過質譜測定的完整分子量結果，可以得出的結論是實驗品中與穩定性相關的產品屬性含量上升，而與質量相關的產品屬性變化不大-這與科研人員的預期相符。