*節 大規模培養技術應用簡介

通過大規模體外培養技術培養哺乳類動物細胞是生產生物制品的有效方法。20世界60-70年代，就已創立了可用于大規模培養動物細胞的微載體培養系統和中空纖維細胞培養技術。近十數年來，由于人類對生長激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細胞介素等生物制品的需求猛增，以傳統的生物化學技術從動物組織獲取生物制品已遠遠不能滿足這一需求。隨著細胞培養的原理與方法日臻完善，動物細胞大規模培養技術趨于成熟。

所謂動物細胞大規模培養技術（large-scale culture technology）是指在人工條件下（設定ph、溫度、溶氧等），在細胞生物反應器（bioreactor）中高密度大量培養動物細胞用于生產生物制品的技術。目前可大規模培養的動物細胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細胞及人二倍體細胞、cho（中華倉鼠卵巢）細胞、BHK-21(倉鼠腎細胞)、Vero細胞(非洲綠猴腎傳代細胞，是貼壁依賴的成纖維細胞)等，并已成功生產了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細胞生成素、單克隆抗體等產品。

在過去幾十年來，該技術經有了很大發展，從使用轉瓶(roller bottle) 、CellCube等貼壁細胞培養，發展為生物反應器（Bioreactor）進行大規模細胞培養。*代細胞培養技術核心問題是難以產業化或者說是規模化生產：一是在工藝生產時不能大規模制備產品；二是非批量生產容易導致產品質量的不均一性；三是難以對同批生產進行生產和質量控制。

隨著生物技術的發展，迫切需要大規模的細胞培養，特別是培養表達特異性蛋白的哺乳動物細胞，以便獲得大量有用的細胞表達產物。采用玻璃瓶靜置或旋轉瓶的培養方法，已不能滿足所需細胞數量及其分泌產物。因而必須為工業化生產開創一種新的技術方法。自70年代以來，細胞培養用生物反應器有很大的發展，種類越來越多，規模越來越大，較常見的細胞培養生物反應器有空氣提升反應器，中空纖維管反應器，無泡攪拌反應器及籃式生物反應器等。八十年代以來，人們逐漸開始以生物反應器培養代替鼠腹水的方法獲得單克隆抗體。

動物細胞是一種無細胞壁的真核細胞，生長緩慢，對培養環境十分敏感。采用傳統的生物化工技術進行動物細胞大量培養，除了要滿足培養過程必需的營養要求外，有必要建立合理的控制模型，進行pH和溶氧（DO）的*控制。細胞生物反應器可通過微機有序地定量地控制加入動物細胞培養罐內的空氣、氧氣、氮氣和二氧化碳四種氣體的流量，使其保持*的比例來控制細胞培養液中的pH值和溶氧水平，使系統始終處于*狀態，以滿足動物細胞的生長對pH值和溶解氧的需要。如為提高或達到一定的溶氧水平可改變通入培養罐內氣體中氧氣和氮氣的比例來實現控制DO值的目的。采用二氧化碳/碳酸氫鈉（CO2/NaHCO3）緩沖液系統來控制培養液的pH值是一種較好的方法。

現在，由于動物細胞培養技術在規模和可靠性方面都不斷發展，且從中得到的蛋白質也被證明是安全有效的，因此人們對動物細胞培養的態度已經發生了改變。許多人用和獸用的重要蛋白質藥物和疫苗，尤其是那些相對較大、較復雜或糖基化（glycosylated）的蛋白質來說，動物細胞培養是的生產方式。60年代初，英國AVRI研究所在貼壁細胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養成功后，從zui初的200ml和800ml玻璃容器開始，很快就放大到30L和100L不銹鋼罐的培養規模。使用的是基于Eagle's配方的培養基，補充5%成年牛血清和蛋白胨。1967年以后，Wellcome（現為Cooper動物保健）集團分布于歐洲、非洲和南美洲8個國家的生產廠商，應用此項技術工業規模化生產口蹄疫疫苗和獸用狂犬疫苗，已掌握了5000L的細胞罐大規模培養技術。

目前已實現商業化的產品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細胞病毒疫苗、α及β干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促紅細胞素、松弛素、生長激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。其中，口蹄疫疫苗是動物細胞大規模培養方法生產的主要產品之一。1983年，英國Wellcome公司就已能夠利用動物細胞進行大規模培養生產口蹄疫疫苗。美國Genentech公司應用SV40為載體，將乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳動物細胞內進行表達，已生產出乙型肝炎疫苗。英國Wellcome公司采用8000L Namalwa細胞生產α干擾素。英國Celltech公司用氣升式生物反應器生α、β和γ干擾素；用無血清培養液在10000L氣升式生物反應器中培養雜交瘤細胞生產單克隆抗體。美國Endotronic公司用中空纖維生物反應器大規模培養動物細胞生產出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生長激素等。 

第二節 大規模培養常用方法

根據動物細胞的類型，可采用貼壁培養、懸浮培養和固定化培養等三種培養方法進行大規模培養。

一、動物細胞生長特性及培養溫度

1、細胞生長緩慢，易污染，培養需用抗生素

2、細胞大，無細胞壁，機械強度低，環境適應性差

3、需氧少，不耐受強力通風與攪拌

4、群體生長效應，貼壁生長（錨地依賴性）

5、培養過程產品分布細胞內外，成本高

6、原代培養細胞一般繁殖50代即退化死亡

依據在體外培養時對生長基質依賴性差異，動物細胞可分為兩類：

貼壁依賴型細胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長，大多數動物細胞，包括非淋巴組織細胞和許多異倍體細胞均屬于這一類。

非貼壁依賴型細胞：無需附著于固相表面即可生長，包括血液、淋巴組織細胞、許多腫瘤細胞及某些轉化細胞。

培養細胞的zui適溫度相當于各種細胞或組織取材機體的正常溫度。人和哺乳動物細胞培養的zui適溫度為35~37℃。偏離這一溫度，細胞正常的代謝和生長將會受到影響，甚至死亡。總的來說，培養細胞對低溫的耐力比高溫高。溫度不超過39℃時，細胞代謝強度與溫度成正比；細胞培養置于39~40℃環境中1h，即受到一定損傷，但仍能恢復；當溫度達43℃以上時，許多細胞將死亡。當溫度下降到30~20℃時，細胞代謝降低，因而與培養基之間物質交換減少。首先看到的是細胞形態學的改變以及細胞從基質上脫落下來。當培養物恢復到初始的培養溫度時，它們原有的形態和代謝也隨之恢復到原有水平。

二、貼壁培養（attachment culture）是指細胞貼附在一定的固相表面進行的培養。

1、生長特性：貼壁依賴型細胞在培養時要貼附于培養（瓶）器皿壁上，細胞一經貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數生長期。一般數天后就鋪滿培養表面，并形成致密的細胞單層。

2、貼壁培養的優點：

容易更換培養液；細胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養液，清洗后直接加入新培養液。

容易采用灌注培養，從而達到提高細胞密度的目的；因細胞固定表面，不需過濾系統。

當細胞貼壁于生長基質時，很多細胞將更有效的表達一種產品。

同一設備可采用不同的培養液/細胞的比例。

適用于所有類型細胞。

3、貼壁培養的缺點：與懸浮培養法相比

擴大培養比較困難，投資大；

占地面積大；

不能有效監測細胞的生長；

4、細胞貼壁的表面：要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。

5、貼壁培養系統：主要有轉瓶、中空纖維（后面專題介紹）、玻璃珠、微載體系統（后面介紹）等。 

轉瓶培養系統：培養貼壁依賴型細胞zui初采用轉瓶系統培養。轉瓶培養一般用于小量培養到大規模培養的過渡階段，或作為生物反應器接種細胞準備的一條途徑。細胞接種在旋轉的圓筒形培養器-轉瓶中，培養過程中轉瓶不斷旋轉，使細胞交替接觸培養液和空氣，從而提供較好的傳質和傳熱條件。

轉瓶培養具有結構簡單，投資少，技術成熟，重復性好，放大只需簡單的增加轉瓶數量等優點。 但也有其缺點：勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細胞生長的表面積小，細胞生長密度低，培養時監測和控制環境條件受到限制等。 現在使用的轉瓶培養系統包括二氧化碳培養箱和轉瓶機兩類。

反應器貼壁培養 此種培養方式中，細胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養液一起流動，因此比較容易更換培養液，不需要特殊的分離細胞和培養液的設備，可以采用灌流培養獲得高細胞密度，能有效地獲得一種產品；但擴大規模較難，不能直接監控細胞的生長情況，故多用于制備用量較小、價值高的生物藥品。

CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應器是常用的貼壁培養式生物反應器，用于細胞貼壁培養時可用籃式攪拌系統和圓盤狀載體。此載體是直徑6毫米無紡聚酯纖維圓片，具很高表面積與體積比（1200cm2/g），利于獲得高細胞密度。籃式攪拌系統和載體培養是目前貼壁細胞培養使用zui多方式，用于雜交瘤細胞、Hela細胞、293細胞、CHO細胞及其它細胞培養。此種方式培養細胞，細胞接種后貼壁快。

三、懸浮培養（suspension culture）：是指細胞在反應器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴型細胞培養，如雜交瘤細胞等；是在微生物發酵的基礎上發通起來的。

無血清懸浮培養是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養方式，它能減少后期純化工作，提高產品質量，正逐漸成為動物細胞大規模培養的研究新方向。

四、固定化培養（immobilization culture）：是將動物細胞與水不溶性載體結合起來，再進行培養。上述兩大類細胞都適用，具有細胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強等優點，細胞易于產物分開，有利于產物分離純化。制備方法很多，包括吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯法、包埋法、微囊法等。

1、吸附法:用固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法（adhesion）。操作操簡便、條件溫和、是動物細胞固定化中zui早研究使用的方法。缺點是：載體的負荷能力低，細胞易脫落。微載體培養和中空纖維培養是該方法的代表，稍后專門介紹。

2、共價貼附法:利用共價鍵將動物細胞與固相載體結合的固定化方法稱為共價貼附法（attachment by covalent bonding）。此法可減少細胞的泄漏，但須引入化學試劑，對細胞活性有影響，且因貼附而導致擴散限制小，細胞得不到保護。

3、離子/共價交聯法:雙功能試劑處理細胞懸浮液，會在細胞間形成橋而絮結產生交交聯作用，此固定化細胞方法稱為離子/共價交聯法（cross-linking by covalent bonding）。交聯試劑會使一些細胞死亡，也會產生擴散限制。

4、包埋法:將細胞包埋在多孔載體內部制成固定化細胞的方法稱為包埋法（entrapment）。優點是：步驟簡便、條件溫和、負荷量大、細胞泄漏少，抗機械剪切。缺點是：擴散限制，并非所有細胞都處于*基質濃度，且大分子基質不能滲透到高聚物網絡內部。一般適用于非貼壁依賴型細胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。

5、微囊法（microencapsulation）:是用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里，細胞不能逸出，但小分子物質及營養物質可自由出入半透膜；囊內是種微小培養環境，與液體培養相似，能保護細胞少受損傷，故細胞生長好、密度高。微囊直徑控制在200-400μm為宜。制備中應注意：

溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作；

所用試劑和膜材料對細胞無毒害；

膜的孔徑可控制，必須使營養物和代謝物自由通過；

膜應有足夠機械強度抵抗培養中攪拌。

五、抗凋亡策略在細胞大規模培養中的應用

生物反應器動物細胞大規模生產過程中，細胞凋亡在細胞死亡中占主要部分。zui近研究顯示在大規模培養生物反應器中細胞的死亡中80%是凋亡所導致,而不是以前所認為的壞死。而在大規模細胞培養中，細胞死亡是維持細胞高活性和高密度的zui大障礙。理論上講，防止或延長細胞死亡，可以極大提高生物反應器生產重組蛋白的產量。

細胞凋亡由一系列基因地調控，是多細胞生物發育和維持穩態所必需的生理現象。已知凋亡的zui終執行者是Caspase家族，它們均為半胱氨酸蛋白酶，各識別一個4氨基酸序列，并在識別序列C端天冬氨酸殘基處將底物切斷。Caspase含有可被自身識別的序列，可以切割活化自身而導致信號放大，并作用于下游Caspase成員，從而形成Caspase家族的級聯放大，zui終作用于效應蛋白，引起細胞凋亡。

所以在大規模培養時干擾細胞在培養中凋亡的發生，提高細胞特異性抵制遇到壓力而引起凋亡的能力，有利于提高細胞的培養密度、延長細胞的培養周期，從而提高目標產品的產量2-3倍。

1、營養物質抗凋亡

在常規生物反應器構造中，營養耗竭或缺乏培養基中特殊的生長因子則引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗盡。培養基中添加氨基酸或其它關鍵營養可抑制凋亡、延長培養時間從而提高產品的生產。大規模培養中細胞凋亡主要由于營養物質的耗竭或代謝產物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是zui常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發生，補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養基中進行培養時，細胞變得更為脆弱，更容易發生凋亡。

2、基因抗凋亡

與凋亡相關的一系列基因產物可對其進行正、負向的調控，因此可通過導入相應基因來調節細胞凋亡的機制。Bcl-2基因是目前zui為有效的抗凋亡基因，在多種細胞系中均表現出很強的抗凋亡活性。

3、化學方法抗凋亡

凋亡發生時細胞許多部位發生生化物質的改變，有些變化如改變細胞氧化還原條件產生活性氧在凋亡信號階段發生，其它的如破壞線粒體膜電位、激活caspase則發生在凋亡效應階段，這在絕大多數細胞死亡中是相同的。因此,阻止這些生化物質的改變可能阻止或至少延遲細胞凋亡的發生，運用化學物質可抑制信號效應階段的發生，被認為是抗調亡策略之一。