組織結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細胞一氧化氮合成酶（cNOS/NOS3/eNOS）活性熒光定量檢測

試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

組織結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細胞一氧化氮合成酶（cNOS/NOS3/eNOS）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過一氧化氮合成酶反應系統(tǒng)，在內(nèi)皮細胞一氧化氮合成酶敏感性抑制劑存在與否的情況下，由底物L-精氨酸被催化產(chǎn)生一氧化氮，進而與熒光探針二氨基熒光素反應，生成強烈熒光產(chǎn)物三唑并熒光素，通過其相對熒光峰值的變化，即采用熒光法來測定樣品中結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細胞一氧化氮合成酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）的結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細胞一氧化氮合成酶的特異活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，重復性好。

技術(shù)背景

一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase；NOS；EC1.14.13.39）是鈣調(diào)蛋白（calmodulin）依賴性或含鈣調(diào)蛋白的細胞色素p450類血紅素蛋白（hemoprotein），分子量為130至160KD的二體蛋白，其催化結(jié)構(gòu)域包括還原酶、加氧酶、黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide；FAD）、核黃素單苷酸（flavin mononucleotide；FMN）等要素，在輔助因子四氫生物喋呤（tetrahydro-biopterin）的幫助下，進行非芳香類氨基酸L-精氨酸（L-arginine）的5’端電子氧化。一氧化氮合成酶催化L-精氨酸末端的氮原子，在還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）和氧氣的參與下，成為一氧化氮（nitric oxide）的合成反應。一氧化氮合成酶有三種異構(gòu)體：神經(jīng)元型（neuronal NOS；nNOS；）、內(nèi)皮細胞型（endothelial NOS；eNOS；NOS3）和巨噬細胞型（macrophage NOS；mNOS；NOS2），前二者為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合成酶（constitutive NOS；cNOS），后者為誘導型一氧化氮合成酶（inducible NOS；iNOS）。其中內(nèi)皮細胞型（eNOS）為膜相關(guān)性蛋白（豆蔻酰化；myristoylation），分布在心血管以及腦血管組織，含有N-末端加氧酶、C-末端還原酶和鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其功能在于作為血管保護分子，維持血管緊張度（vascular tone）和完整性，同時受到鈣離子、鈣調(diào)蛋白、磷酸化等調(diào)節(jié)。基于底物L-精氨酸，在eNOS敏感性抑制劑亞胺乙基鳥氨酸（L-N⁵(1-iminoethyl)- L-ornithine；L-NIO）存在與否的情況下，通過NADPH和氧氣的參與，由一氧化氮合成酶催化產(chǎn)生一氧化氮氣體和瓜氨酸（citrulline）；進而使用特異性熒光探針二氨基熒光素（4,5-diaminofluorescein；DAF-2）與一氧化氮反應，生成強烈熒光產(chǎn)物三唑并熒光素（triazolofluorescein；DAF-2T），通過其相對熒光峰值的變化（激發(fā)波長495nm，散發(fā)波長515nm），來定量分析結(jié)構(gòu)型內(nèi)皮細胞一氧化氮合成酶的特異活性。其反應方式為： 

eNOS

L-arginine  +  NADPH  +  O2   →   nitric oxide  +  citrulline  +  NADP

L-NIO

DAF-2  +  NO +  O2  →  DAF-2T

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  20毫升

緩沖液（Reagent C）   5毫升

反應液（Reagent D）   1毫升

顯色液（Reagent E）   250微升

標準液（Reagent F） 100微升

專性液（Reagent G） 100微升

產(chǎn)品說明書      1份

保存方式

保存反應液（Reagent D）、顯色液（Reagent E）、標準液（Reagent F）和專性液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 顯色液（Reagent E）和標準液（Reagent F）避免光照；有效保證6月

用戶自備

*緩沖液（Reagent H）：用于檢測純化內(nèi)皮細胞型一氧化氮合成酶或體外檢測

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于制備樣品和標準品的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品處理

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織樣品

恒溫水槽：用于反應孵育

黑色96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于熒光分析的容器

熒光酶標儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析

實驗步驟

一、樣品準備

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗
• （選擇步驟）抽去清理液
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入1毫升裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化（約80下）
• 將所有勻漿物移入2毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取1毫升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作