大腸桿菌類感受態細胞HB101制備原理及方法

摘要： 目前,感受態細胞的制備常用冰預冷的CaCl2處理細菌的方法制備,即用低滲CaCl2溶液在低溫（0℃）時處理快速生長的細菌,從而獲得感受態細菌.本方法的關鍵是選用的細菌必須處于對數生長期,實驗操作必須在低溫下進行.

原理：

目前, 感受態細胞 的制備常用冰預冷的CaCl2處理 細菌 的方法制備,即用低滲CaCl2溶液在低溫（0℃）時處理快速生長的細菌,從而獲得感受態細菌.此時細菌膨脹成球形,外源 DNA 分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附在 細菌 表面,通過熱激作用促進細胞對DNA的吸收.轉化效率可達106-107轉化子/微克DNA.
本方法的關鍵是選用的細菌必須處于對數生長期,實驗操作必須在低溫下進行.

操作：

1、取-70℃冰凍菌種,用劃線法接種細菌于培養皿,做好標記,于37℃培養過夜.

2、第二天,從平板上挑取單個菌落,接種至含有3ml LB培養液的試管中,37℃振蕩培養過夜.次日取菌液1ml接種至含有100ml LB培養基的500ml燒瓶中,37℃劇烈震蕩培養約2~3小時（200~300r/min）

3、當菌落600nm OD值達到0.3-0.4時,將燒瓶取出放置冰上10~15分鐘.在無菌條件下把菌液倒入50ml離心管中.4℃,4000g離心10分鐘.

4、棄上清,將管倒置于干濾紙上1min,吸干殘留的培養液.加10ml 0.1M的CaCl2到離心管中,振蕩混勻,懸浮菌體,冰浴30分鐘.

5、4℃,4000g離心10分鐘,棄上清,將管倒置于干濾紙上1min,吸干殘留的培養液.加4ml冰預冷的0.1M的CaCl2,重懸浮菌體.每管0.2ml分裝,至4℃保存備用,24-48小時內使用效果較好.如果暫時不用,可再保存于-70℃的低溫冰箱中.