冷凍保藏是指將菌種于-20 ℃以下的溫度保藏， 冷凍保藏為微生物菌種保藏十分有效的辦法。經(jīng)過冷凍，使微生物代謝活動中止。一般而言，冷凍溫度愈低，作用愈好。為了保藏的成果愈加令人滿意，通常在培育物中加入一定的冷凍保護劑;一起還要認真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺陷是培育物運輸較困難。

*先要給大家說的就是液氮冷凍保藏技術：近年來，有特殊意義和特征的高等動、植物細胞能夠在液氮中保藏，并發(fā)現(xiàn)在液氮中保藏的菌種的存活率遠比其他保藏方法高且回復突變的發(fā)生率極低。液氮保藏巳成為工業(yè)微生物菌種保藏的*好方法。具體方法是：把細胞懸浮于一定的分散劑中或是把在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的菌種直接進行液體冷凍，然后移至液氮(-196 ℃)或其蒸汽相中(-l56 ℃)保藏。進行液氮冷凍保藏時應嚴格控制致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先制備冷凍保藏菌種的細胞懸液，分裝0.5～1 mL入玻璃安瓿或液氮冷藏塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然后以(1-2) ℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結點(通常為-30 ℃)。待細胞凍結后，將致冷速度降為1 ℃/min，直到溫度達到-50 ℃，將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196 ℃)或氣相(-156 ℃)中保存。如果無控速冷凍機，則一般可用如下方法代替：將安瓿或液氮瓶置于-70 ℃冰箱中冷凍4 h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中，*常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，*終使用濃度一般為甘油10 %、二甲亞砜5 %。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜*好為過濾滅菌。

冷凍保藏菌種有哪些切實可行的方法?

普通冷凍保藏技術(-20 ℃)：將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，于冰箱的冷藏室中貯藏，或于溫度范圍在-5～20 ℃的普通冰箱中保存。或者將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細胞分別接到試管或指管內，嚴格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1～2年。應注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的保藏。

超低溫冷凍保藏技術：要求保藏的微生物菌種，一般都應在-60 ℃以下的超低溫冷藏柜中進行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是：先離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞，再用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞，然后加入等體積的20 %甘油或10 %二甲

亞砜冷凍保護劑，混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70 ℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在(1～2) ℃/min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。

真空凍干保藏：真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養(yǎng)到*大穩(wěn)定期后，一般培養(yǎng)放線菌和絲狀真菌約需(7～10) d，培養(yǎng)細菌約需(24～28) h，培養(yǎng)酵母約需3 d。然后混懸于含有保護劑的溶液中，保護劑常選用脫脂乳、蔗糖、動物血清、谷氨酸鈉等，菌液濃度為(109～1019)個/mL，取(0.1～0.2) mL菌懸液置于安瓿管中冷凍，再于減壓條件下使凍結的細胞懸液中的水分升華至1 %～5 %，使培養(yǎng)物干燥。*后將管口熔封，保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種保藏的*為有效的方法之一，大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。但操作過程復雜，并要求一定的設備條件。