在細胞上做基因研究的一般的過程就是：利用CRISPR-Cas9先做基因除 (Gene Knockout) ，獲得基因敲除細胞系純合細胞：然后分析相關的生物學表型；最后做為對照還需要將原敲除的基因回補會到原細胞系中，做為對照細胞進行實驗對比。而利用Cas9進行細胞敲除之后，細胞回補實驗室要注意哪些問題? 特別需要考慮的技術原理是那些？如何規劃好實驗流程，下面我們就一步步的進一下細胞其因敲除和回補實驗的效率/價格/周期等。

一、敲除細胞的方式

一般都是純合基因敲除細胞，當然也可以選擇MixClone的方式；純合基因敲除，基本就是目的基因的所有的拷貝都被敲除，沒有任何一個完整的基因拷貝可以起作用；這樣的好處就是背景非常干凈，做敲除最大的優勢也得以體現，缺點就是效率較低，對細胞系要求較高，必須能夠形成單克隆MixClone細胞敲除Cell Pool就是成本低，適合大規模篩選，從整體上看生物學表型的影響；缺點就是要看效果，有很多時候效果遠不如純合基因敲除，背景還在。

MixClone™極大地簡化了基因編輯流程，周期短至四周，價格只有RNA干擾的一半；技術方法和嚴格的工藝流程控制，基因編輯效率可以高達80-95%，可直接用于下游基因功能分析。

 

MixClone™的技術流程

二、細胞基因敲除的方法選擇

1. 細胞基因敲除策略一-移碼敲除：

優點：設計簡單，單gRNA就可以發揮作用，成本低；
缺點：鑒定麻煩，需要測序，難以保證一個基因有同樣基因型，所以分析麻煩，要保證全都是非3的倍數的移碼才能夠保證基因敲除，所有很多細胞系是用移碼做不到的(基因拷貝數多)。

2. 細胞基因敲除-Cas9X大片段基因敲除：
優點：鑒定簡單，可以通過對敲除片段外部設計primer進行目的片段的擴增，同時所有的基拷貝都基本能夠導入一致的基因缺失，功能分析簡單；

缺點：技術復雜，需要有雙gRNA對目的基因片段進行切割，而且要中間片段刪除的克隆，成本高、效率較低，其次需要非常多的克隆分析才能有結果，需要更多的篩選克隆工作量。

總結:

移碼敲除：是在外顯子上切一下，導致非3的堿基缺失或者改變，從而實現整個外顯子的蛋白序列的改變(但是對細胞有多染色體，多核現象的細胞，就是多個基因拷貝的細胞，這個基本無法去干凈) ； 移碼的gRNA作用在外顯子上！

大片段敲除：就是在內含子設計一對gRNA，將非3整數的外顯子整個片段的刪除，或者是整個基因片段的刪除; (除了技術復雜，貴點，什么細胞系都能用) ; gRNA一般在內含子上切。

三、基因敲除細胞系的構建策略

1. 通過病毒法穩轉Cas9+gRNA獲得基因敲除細胞系的流程: 構建載體+包病毒+轉染+篩選+克隆+PCR【持續表達，周期長，成本高，效率高】。

2. 通過質粒法瞬轉Cas9+gRNA獲得基因敲除細胞系的流程: 構建載體+轉染+克隆+PCR 【階段表達，周期短，成本低，效率低】。

3. 通過Cas9X*穩轉獲得的基因敲除細胞系的流程: 構建載體+轉染+篩選+克隆+PCR【持續表達，周期短，成本低，效率高】。

4. 通過Cas9蛋白+gRNA獲得基因敲除細胞系的流程: 轉染+克隆+PCR【階段作用，周期短，成本高，效率低】。

總結可以分為兩類：持續的表達Cas9+gRNA與階段性表達Cas9+gRNA兩種。

四、基因回補實驗的需要特別注意的問題
1. 一般都是cDNA的回補99%都是用cDNA來做回補，除非有錢的可以使用BAC大片段來做回補的 (可以考慮一下我們的VIRUS-Free技術)。

2. cDNA會不會被gRNA識別切割? 如果是Cas9持續表達的，而且gRNA是作用在外顯子的肯定會!所以要特別注意做回補的時候，移碼突變的必須要做cDNA突變(就是同義突變，將CRISPR識別的PAM序列去掉才行);要不回補的CDNA也會被切割破壞掉，所以我們不推薦做移碼敲除是有原因的，前面省的錢后面再花回去。[注意：之前報道Cas9是可以編輯mRNA的，所以......移碼除技術的問題后面比較復雜，很多人做回補實驗沒有檢測到，這個也是其中原因之一]

Cas9X的所有大片段敲除的切割在內含子上，一般沒有在cDNA上面有識別切割位點，所以回補實驗就簡單很多!

除此之外，Cas9X的核心技術還具備“0”偏差的將Cas9模塊移除，有需要的科學家可以向我們提出，我們可以將Cas9模塊在交付的敲除細胞株里面移除。是不是就更加的放心了?

3. 回補的鑒定問題?

要特別注意移碼突變的過程中，有一定概率出現的WB背景雜帶的問題比較麻煩? 回補之后的序列可能會干擾到回補片段的表達鑒定。

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