細胞培養過程中細胞質控方案

來源：蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司 2023年04月07日 10:03

正如人有喜怒哀樂，細胞也是如此，細胞的活力和狀態是不斷變化的，而非一成不變的。在細胞體外培養的過程中，離開機體保護的細胞是很脆弱的，在陌生的生長環境下即便是培養條件的輕微改變，也可能對細胞產生無法預估的影響。在原代細胞培養過程中，即使保持培養條件一致，在傳代過程中，細胞的存活質量也是逐漸下降的。

以人臍靜脈內皮細胞（HUVEC細胞）為例，HUVEC細胞是研究內皮細胞功能的經典體外細胞模型。在心血管疾病的研究中，主要用于研究內皮細胞功能改變或損傷后其衍生細胞因子對血壓的影響；在腫瘤研究中，主要用于實體瘤中血管生成的研究。然而，HUVEC在傳代培養過程中，其活力是逐漸衰退的，因此細胞傳代最多不超過10代。

新鮮的HUVEC

衰老的HUVEC

傳統的細胞培養主要是通過顯微鏡下形態學變化以及傳代培養周期的變化預估細胞生長生存狀態。這種主觀判斷既無法量化，也無法進行統計學分析。因此，目前對細胞存活質量的判斷并沒有準確、客觀的統一標準，并且對體外培養細胞的存活質量控制往往被科研工作者們“忽略”，從而導致實驗結果的不穩定。

體外細胞的有效培養新概念——“細胞質控”。通過細胞活力、細胞凋亡、細胞周期、細胞增殖及DNA損傷五方面對細胞生長生存狀態進行監控。

在這五個方面中，影響最大的便是細胞活力，下面咱們專門來談一談細胞活力如何判斷。在體外細胞培養的過程中，細胞總有一些因各種原因而死亡，總細胞中活細胞所占的百分比，即是我們常說的細胞活力。“細胞質控”中最基礎的指標便是細胞活力。常見的流式細胞設備及部分細胞計數儀器都可以對細胞進行絕對計數，還可以提供準確、客觀的細胞活力數據，為“細胞質控”提供準確、客觀的統計學依據，細胞活力評估并不困難！

滿足以下兩個條件就可以進行細胞活力檢測

1. 正常細胞的細胞膜是完整的。

Propidium iodide（PI碘化丙啶）是一種核酸染料，常用于細胞凋亡(apoptosis)或細胞壞死(necrosis)的檢測和流式細胞儀分析。PI不能通過正常完整的細胞膜，故細胞在處于壞死或晚期凋亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色，可以用來分辨壞死細胞/正常細胞。

2. 加入另一種可以透過細胞膜的核酸染料，就可以通過兩種染料將活細胞和死細胞區分開。

PI經常被用來與Calcein-AM或者FDA等熒光探針一起使用，能同時對活細胞和死細胞染色。PI-DNA復合物的激發和發射波長分別為535 nm和615 nm。

細胞活力的技術標準界定

應用案例：納米藥物毒性測試

納米藥物的研究是近年來新藥研發的熱點。納米藥物載體篩選的首要標準是檢測其對細胞的毒性。而在細胞毒性測試中，首先要排除的是基底培養過程中產生的死細胞，即“噪音信號”。在對新型納米藥物載體SEONLA的研究中，Zaloga等人認為只有活細胞比例超過90%方可進行細胞毒性研究，細胞質控的重要性由此可見一斑。

細胞毒性的入門級指標是細胞活力。判斷一種物質（化合物、小分子藥物或蛋白質等）對細胞的毒性首先要觀察的是其是否或誘導細胞死亡，即細胞活力的變化。以維生素C為例，研究發現，高濃度維生素C對眼癌細胞Y79 Retinoblastoma Cells具有殺傷作用。文章中，作者以眼癌常用化療藥Melphalan作為對照，對經過處理的細胞活性進行檢測，發現，隨著濃度的升高，維生素C對Y79 Retinoblastoma Cells殺傷作用逐漸增強，并且維生素C對眼癌細胞的殺傷作用優于Melphalan。這一實驗結果為眼癌更安全、更有效的治療方案的提出提供了理論依據。

細胞質控儀測得數據

除了細胞毒性研究，細胞質控在病毒感染或者RNA轉染的研究中也是非常重要的。在這一類研究中，轉染/感染試劑或多或少都會對細胞有一定殺傷作用。因此，在轉染之前，活細胞需要達到一定的比例才可以保證在轉染之后有足夠數量的細胞進行后續的研究。而這一比例需要實驗條件摸索才能確定。

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