體外定點(diǎn)突變技術(shù)是當(dāng)前生物學(xué)各領(lǐng)域研究中的一種重要實(shí)驗(yàn)手段，是改造、優(yōu)化基因的便捷方案，是探索啟動(dòng)子調(diào)節(jié)位點(diǎn)的有效手段，也是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具。

 
   蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，二者之間的關(guān)系是蛋白質(zhì)組研究的重點(diǎn)之一。對(duì)某個(gè)已知基因的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變、缺失或者插入，可以改變對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對(duì)突變基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行研究有助于人類了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，探討蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/結(jié)構(gòu)域。
 
CRISPR-Cas9系統(tǒng)的靶向雙鏈斷裂（DSB），基因組通常通過(guò)非同源端連接（NHEJ）進(jìn)行修復(fù)，通過(guò)插入和缺失誘導(dǎo)基因敲除（Indels）。基因敲入和精確突變的引入可以通過(guò)使用供體DNA模板的同源定向修復(fù)（HDR）來(lái)實(shí)現(xiàn)，但其效率通常很低，可通過(guò)增加抗性篩選來(lái)富集陽(yáng)性克隆，但獲得純合克隆的概率極低。這阻礙了該技術(shù)在臨床應(yīng)用中的發(fā)展。但研究發(fā)現(xiàn)使用ssodn作為供體模板時(shí)，因?yàn)閟sodn片段較短，同源定向修復(fù)（HDR）獲得純合的概率遠(yuǎn)高于DNA模板的同源定向修復(fù)。
 
常用的定點(diǎn)突變CRISPR-Cas9系統(tǒng)電轉(zhuǎn)方法是將 gRNA 和 Cas9 蛋白孵育結(jié)合為 RNP，加入ssodn一起電轉(zhuǎn)到靶細(xì)胞中，進(jìn)行單 sgRNA 切割。實(shí)現(xiàn)突變位點(diǎn)周圍基因斷裂。
 
如何快速高效構(gòu)建自己的基因突變細(xì)胞株是很多人關(guān)心的問(wèn)題，我們梳理了3個(gè)步驟幫你顯著提高點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)成功率：
（1）切割位點(diǎn)到突變位點(diǎn)的距離；
（2）引入同義突變，防止Cas9-sgRNA的二次切割；
（3）通過(guò)優(yōu)化距離提高純合或者雜合的偏向性。
 
1. 切割位點(diǎn)到突變位點(diǎn)的距離
 
獲得純和點(diǎn)突變細(xì)胞株首要標(biāo)準(zhǔn)是切割位點(diǎn)到突變位點(diǎn)的距離，最好不要超過(guò)10bp,小于5bp為最佳。突變位點(diǎn)距離切割位點(diǎn)越近越好。
圖片
因?yàn)槎c(diǎn)突變HDR修復(fù)并不需要完整的同源臂作為修復(fù)模板，細(xì)胞可以僅使用同源臂的一部分用于HDR修復(fù)，這使得遠(yuǎn)離Cas9-sgRNA切割位點(diǎn)的突變，無(wú)法被有效整合進(jìn)基因組。
 
研究發(fā)現(xiàn)，突變整合效率隨著與突變位點(diǎn)到切割位點(diǎn)距離的增加而迅速下降。與切割位點(diǎn)距離10bp整合效率下降約一半，超過(guò)30bp則一般無(wú)法整合到基因組。
 
因此，我們通常建議突變位點(diǎn)與切割位點(diǎn)的距離不超過(guò)10bp，從而保證較高的整合效率。（這個(gè)也是Cas9X | 海星生物為什么建議細(xì)胞的點(diǎn)突變附近要有合適的gRNA序列）

 
2. 引入同義突變，防止Cas9-sgRNA的二次切割
同義突變是指：同義突變是DNA 片段中有時(shí)某個(gè)堿基對(duì)的突變并不改變所編碼的氨基酸。其原因在于該位置的密碼子突變前后為簡(jiǎn)并密碼子。點(diǎn)突變一般采用單鏈寡核苷酸（ssDNA）作為HDR模板，可以通過(guò)在PAM位點(diǎn)或者guide區(qū)域靠近PAM位點(diǎn)引入突變的方式，顯著降低二次切割的概率。
 
 
如果點(diǎn)突變位點(diǎn)距離PAM位點(diǎn)較遠(yuǎn)（＞10bp），通常可以在PAM位點(diǎn)附近引入同義突變，防止二次切割。如果PAM位點(diǎn)或者guide區(qū)域不在編碼區(qū)域上，無(wú)法引入同義突變，該P(yáng)AM位點(diǎn)或者guide區(qū)域不影響外顯子剪切對(duì)該基因無(wú)影響時(shí)可直接引入突變。否則可以通過(guò)兩步法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：第一步，先引入點(diǎn)突變和PAM位點(diǎn)突變，獲得雙突變的陽(yáng)性克隆；第二步，將PAM位點(diǎn)突變回野生型，獲得僅靶位點(diǎn)突變的陽(yáng)性克隆。同義突變要選擇突變成此轉(zhuǎn)錄本被廣泛使用的氨基酸對(duì)應(yīng)密碼子，不要選擇稀有密碼子。
 
3. 通過(guò)優(yōu)化距離提高純合或者雜合的偏向性
有一些課題研究，如阿爾茨海默氏病的研究，是需要用到雜合突變的。而通過(guò)優(yōu)化突變位點(diǎn)與切割位點(diǎn)的距離，可以幫助我們更有效地獲得雜合或者純合的突變克隆。

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