原代分離細胞培養是指從供體內取出組織后，經機械以及消化分離成單個細胞或單一型細胞群，使之在體外模擬人體生理環境，在無菌、適當溫度和一定的營養條件下，生存、生長和繁殖。原代培養細胞常有不同的細胞成分，生長緩慢，但是更能代表所來源的組織細胞類型和表達組織的特異性特征。利用原代細胞培養做各種實驗，如藥物測試、細胞分化及病毒學方面的試驗效果很好。

操作步驟：

1、剪切組織：先將所取得的組織，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手術鑷去除黏附的結締組織等非培養所需組織。再次清洗后，用手術刀將組織切成若干小塊，移入青霉素小瓶或小燒杯中，加入適量緩沖液，用彎頭眼科剪，反復剪切組織，直到組織成糊狀，約1mm3大小。靜置片刻后，用吸管吸去上層液體，加入適當的緩沖液再清洗一次。

2、消化分離：消化分離的目的是將細小的組織塊消化分離成細胞團或分散的單個細胞，以利于進一步的培養，常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶。

3、培養：細胞懸液用計數板進行細胞計數。用培養液將細胞數調整為（2～5）×105 cells／ml，或實驗所需密度，分裝于培養瓶中，使細胞懸液的量以覆蓋后略高于培養瓶底部為宜。置CO2培養箱內，5％CO2，37℃靜置培養。一般3～5d，原代培養細胞可以黏附于瓶壁，并伸展開始生長，可補加原培養液量1／2的新培養液，繼續培養2～3d后換液，一般7～14d可以長滿瓶壁，進行傳代。

注意事項：

（1）無菌操作：細菌或霉菌污染是培養失敗的常見原因，必須加強各個環節的無菌操作觀念，以預防為主，一旦污染，一般很難消除。

（2）培養液：所用的培養液必須滿足細胞生存和生長的必要條件。由于細胞來源的動物種類、組織類型不同，對培養液的要求有一定的差異，必要時可用預實驗的方法選擇適當的培養液。

（3）胎牛血清：胎牛血清對于維持培養細胞的生存和促進細胞增殖起著關鍵性作用。可選擇多種不同批號的胎牛血清進行小樣分析。一旦確定某一廠家的某一批號胎牛血清后，就保持應用至實驗完成。想了解血清的秘密，可以參考Nothing：關于血清，你不知道的太多了

（4）膠原酶溶液：必須新鮮配制，貯存時間過長(即使是-20℃低溫保存)，也將影響消化效力，導致消化時間過長，細胞損傷增加。

（5）L-谷氨酰胺：幾乎所有細胞對谷氨酰胺都有較高的要求，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，在缺少谷氨酰胺時，細胞會因生長不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不穩定，加有谷氨酰胺的培養液在4℃冰箱貯存兩周以上時，就應重新加入原來量的谷氨酰胺。

（6）靜置培養：原代細胞在消化分離后，置于CO2培養箱的頭24～48h (必要時72h)內，應處于絕對靜置狀態，切忌不時地取出培養瓶觀察生長狀況，這將使原代分離細胞難以貼壁，更談不上伸展和增殖，初學者尤應注意。不必擔心培養液中的營養成分會消耗光，在細胞增殖之前對營養的要求并不大。原代培養初期僅加一薄層培養液的目的也在于有利于細胞貼壁伸展。

（7）消化時間：一般消化至肉眼尚可見微小組織顆粒即可，因為此時組織顆粒已經松散，略經吹打即成細胞團或單個細胞，過久的消化往往導致細胞損傷加重，細胞培養成活率降低。

（8）其他生長因子：經過以上處理，一般原代分離細胞培養均可以成功。對于少數特殊類型細胞也可以考慮加一些特殊的生長因子，如胰島素能促使細胞攝取葡萄糖和氨基酸。另外，內毒素、EGF、FGF等均有促有絲分裂作用，但費用較高。