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ProteanFect CRISPR Ultra 轉染試劑盒產品詳解 產品簡介

來源:重慶市華雅干細胞技術有限公司   2025年06月13日 15:03  

ProteanFect CRISPR Ultra 轉染試劑盒產品詳解

產品簡介

ProteanFect CRISPR Ultra 轉染試劑盒是ProteanFect系列中專為難轉細胞系基因編輯而設計的創新產品。該試劑盒基于自組裝蛋白納米顆粒技術,作為一種非病毒、非電轉、非脂質體的轉染試劑,能夠高效且安全地將基因編輯工具RNP(包含Cas9蛋白和guide RNA)遞送至細胞內,從而實現高效的基因編輯。


儲存與成分

運輸與儲存?:ProteanFect CRISPR Ultra 轉染試劑盒采用干冰運輸,收到后應立即存放于-80℃直至使用。

試劑盒規格?:依據Reagent B的體積設定。

試劑盒組分及存儲?:

Reagent A(PT07):使用后保存于2-8℃。

Reagent B(PT07):保存于-20℃,避免反復凍融。

Cas9 protein(1 µg/µL):保存于-80℃,避免反復凍融。

EGFP mRNA(1 µg/µL):陽性對照,保存于-80℃,避免反復凍融。

Human TRAC-sgRNA(1 µg/µL):陽性對照,靶向序列為TGTGCTAGACATGAGGTCTA,保存于-80℃,避免反復凍融。


實驗前準備

待轉染細胞?:細胞必須處于良好的生長狀態,活率>90%。

推薦培養基?:Opti-MEM培養基(或無血清的RPMI 1640培養基/無血清DMEM培養基),提前預熱至室溫。

轉染試劑?:室溫自然解凍,顛倒或渦旋至溶液均一后使用。

其他材料?:完·全培養基、無菌EP管、所需轉染的核酸樣品。

操作步驟(以96孔板體系為例)

配置ProteanFect轉染體系?:

在40 µL Reagent A(PT07)中加入0.8 µg(約5 pmol)Cas9 protein和0.3 µg(約10 pmol)sgRNA,充分混勻。

加入1.4 µL Reagent B(PT07),移液槍上下吹打20-30次或渦旋10秒,使其充分混勻。配置完成后置于冰上保存;如需在室溫下保存,須在30分鐘內使用完畢。

細胞處理?:

懸浮細胞?:取待轉染細胞,300g離心5分鐘,棄去上清后以Opti-MEM重懸細胞沉淀,再次離心,最終用Opti-MEM重懸并調整細胞濃度至5×10? - 1×10? cells/mL備用。

貼壁細胞?:轉染前匯合率保持在50%-80%,棄去培養基后,用Opti-MEM輕柔清洗細胞兩次,并加入20 µL Opti-MEM備用。

細胞轉染?:

將配置好的ProteanFect轉染體系與20 µL細胞懸液混合后,在離心管中孵育(或直接加入貼壁細胞中)。

37℃培養箱孵育45-60分鐘(孵育時間可根據不同細胞類型進行適當調整)。

加入約5倍轉染體系體積的完·全培養基,300g離心5分鐘,棄去上清(貼壁細胞可直接棄去混合液并補加培養基)。

細胞培養與觀察?:

加入適量完·全培養基,進行細胞培養,72小時后可對靶點進行編輯效率分析。

轉染不同規格孔板的使用含量

以下提供了不同規格孔板轉染時的各組分使用含量:

孔板類型Reagent A(PT07)Cas9 protein/sgRNAReagent B(PT07)推薦每孔細胞數(Opti-MEM)

96孔40 µL0.8 µg/0.3 µg1.4 µL1×10^5~2×10^5(20 µL)

48孔80 µL1.6 µg/0.6 µg2.8 µL2×10^5~4×10^5(40 µL)

24孔200 µL4 µg/1.5 µg7 µL4×10^5~1×10^6(100 µL)

12孔600 µL7.5 µg/4.5 µg21 µL1×10^6~3×10^6(300 µL)

6孔800 µL16 µg/6 µg28 µL2×10^6~4×10^6(400 µL)

數據分享

使用ProteanFect CRISPR Ultra轉染試劑盒轉染Jurkat細胞,并使用試劑盒中的Human TRAC-sgRNA陽性對照敲除TRAC基因。轉染72小時后,收集細胞DNA水平檢測基因敲除效率。結果顯示,陽性對照組中靶點基因被編輯的比例約為63.4%,平均編輯效率約為63.9%。

常見問題解答

如何提升轉染效率??

根據細胞類型和培養條件優化轉染條件。

適當延長轉染時間(通常細胞系不超過2小時)。

適當增加轉染體系至初始的1.5-2.5倍。

細胞系轉染前處理??

使用活性超過90%的細胞。

不建議使用傳代次數超過15次的細胞。

新復蘇的細胞需傳代2-3次后使用。

關于EGFP mRNA陽性對照的使用??

首·次嘗試時,建議設置陽性對照組(EGFP mRNA),以檢測實驗操作和試劑的有效性。使用96孔板的細胞量即可,節省細胞和試劑。

RNP的投入量如何確定??

Cas9蛋白和sgRNA的摩爾比推薦在1:1-1:2.5之間。

以96孔細胞量的轉染體系為例,Cas9蛋白的投入量在0.8 µg-1.6 µg。

轉染后的細胞處理??

轉染后,細胞狀態可能與未處理組略有差異。但使用ProteanFect試劑進行轉染時,對細胞活力的損傷較小。通常在轉染后第二天,細胞狀態會基本恢復。

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