使用 Gibco 細胞解離試劑來分離貼壁細胞和組織

為了獲得合適數量的細胞進行研究，必須先從較大培養物中分離出一組細胞。進入：細胞解離。Gibco 胰蛋白酶和替代細胞解離產品是組織和單層細胞的理想之選。提供多種形式，包括酶促和化學形式，以滿足研究人員進行貼壁細胞培養的不同需求。探索以下選擇指南，為您的細胞培養類型選擇正確的細胞解離試劑。

胰蛋白酶和細胞蛋白酶化

胰蛋白酶是一種蛋白水解酶，是分離貼壁細胞培養物和單層細胞的標準方法。這種球狀胰腺蛋白酶在賴氨酸和精氨酸的 C 端裂解，分解血管粘附蛋白，并可在細胞收獲過程中輕易重懸。

賽默飛世爾科技提供豬胰蛋白酶，EDTA 增強胰蛋白酶以及 TrypLE 酶制劑的配方，這是一種溫和的胰蛋白酶樣酶。為避免計劃外的蛋白質降解，必須使用胰蛋白酶抑制劑滅活有機胰蛋白酶。相比之下，合成胰蛋白酶（如 Gibco TrypLE 產品）通過稀釋滅活，無需額外的溶液。

注：如果細胞培養基中含胎牛血清（FBS），在胰蛋白酶化之前需要用平衡鹽溶液清洗培養物，以確保胰蛋白酶的功能。

胰蛋白酶-EDTA  

EDTA 是一種螯合劑，可提高胰蛋白酶分離貼壁細胞的能力。EDTA 將鈣和鎂結合成六齒結構，削弱細胞間粘附，增強胰蛋白酶對水解靶向肽鍵的獲取。

Gibco 胰蛋白酶-EDTA 由經過電子束驗證的輻照豬源蛋白酶制成，并經過 PPV、支原體和 PCV 1/2 污染測試。

幫助實現與 TrypLE 試劑的溫和細胞解離

Gibco TrypLE 試劑是高度純化的重組細胞解離酶，可替代豬胰蛋白酶。這些試劑非常適合在含血清和無血清條件下解離貼壁依賴細胞系，無需更改方案即可直接替代胰蛋白酶。TrypLE 試劑對細胞溫和，在室溫下穩定，無動物源性。

TrypLE 酶是血清添加和不含血清條件的理想選擇，是無動物源性胰蛋白酶樣酶的答案。這種酶表現出與胰蛋白酶相似的 pH 值活性譜，在精氨酸和賴氨酸處裂解。由于 TrypLE 酶的無動物來源，消除了潛在致病污染物的危害；并經過受控的發酵過程，TrypLE 酶可以在任何規模下供應。

查看比較圖：胰蛋白酶、胰蛋白酶 EDTA 與 TrypLE 試劑

胰蛋白酶抑制劑

胰蛋白酶抑制劑破壞性地改變胰蛋白酶，使蛋白水解酶與蛋白質結合并消化蛋白質的能力失效。胰蛋白酶抑制劑用于解離后，保護細胞免受胰蛋白酶進一步的蛋白質降解。

注：大豆胰蛋白酶抑制劑也可結合胰凝乳蛋白酶，盡管程度較小。

胰蛋白酶抑制劑比較圖

膠原酶

相對溫和的膠原酶以通過消化結締組織的天然三螺旋膠原纖維而起其作用。這些組織通常存在于皮膚、肌腱、血管和骨骼中—因此膠原酶解聚適用于人類腫瘤、小鼠腎臟、人腦和上皮培養物。

從原代組織中進行細胞分離實驗產品和步驟：

TrypLE™ 產品

TrypLE™ 產品的配方可直接替代您現有的方案。下列通用步驟可用于去除培養皿中多種細胞系，同時保持細胞完整性。應根據經驗確定各系統可采用的優化條件和濃度。

1. 從培養瓶中慢慢倒出培養基。使用不含鈣和鎂的 5 ml Dulbecco 磷酸緩沖鹽溶液 (D-PBS) 來沖洗培養瓶（Gibco 貨號 14190）。慢慢倒出 D-PBS。

2. 向培養瓶加入適量（即在 75 cm2 培養瓶中加入 2 ml）且預熱的 TrypLE™。搖動容器，以覆蓋細胞層。

3. 37°C 下孵育直至細胞分離（每 5 分鐘觀察一次）。輕輕敲打容器以清除細胞。

4. 用 2 至 5 ml 細胞培養生長培養基進行稀釋，然后將細胞懸液轉移至 15 ml 離心管中。

5. 以 100 × g 離心 5 到 10 分鐘。丟棄上清液，用 2 至 5 ml 新鮮生長培養基懸浮細胞沉淀。

胰蛋白酶

1. 去掉多余的組織后，使用無菌手術刀或剪刀，將剩余組織切成 3-4 mm 的小塊。將組織塊重懸于不含鈣和鎂的平衡鹽溶液中，進行洗滌。待組織塊沉降，去除上清液。重復洗滌 2 到 3 次。

2. 將盛有組織塊的容器置于冰上，去除殘留的上清液。在 不含鈣和鎂的平衡鹽溶液中加入 0.25% 的胰蛋白酶（100 mg 組織加入 1 ml 胰蛋白酶）。

3. 在 4°C 下孵育 6 至 18 小時，以大幅度地增加幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶的滲透率。

4. 慢慢倒出并丟棄組織塊中的胰蛋白酶。將組織塊以及殘留胰蛋白酶在 37°C 下孵育 20 至 30 分鐘。

5. 向組織塊中加入溫熱的培養基，用移液管上下吹吸輕輕分散組織。如果使用無血清培養基，還要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

6. 通過無菌不銹鋼絲網（100 至 200 µm）過濾細胞懸液，分散剩余組織。計數和接種細胞，進行培養。

膠原酶

1. 使用無菌手術刀或剪刀，將組織切成 3-4 mm 的小塊。使用 Hanks 平衡鹽溶液 (HBSS) 洗滌組織塊數次。

2. 加入膠原酶（50 至 200 單位/ml，溶解在 HBSS 中）。

3. 在 37°C 下孵育 4 至 18 小時。加入 3 mM CaCl2 可增加解離效率。

4. 通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，將分散細胞和組織碎片與較大的組織塊分開。如果需要進一步的解聚 ，在組織塊中加入新鮮的膠原酶。

5. 通過離心在 HBSS 中洗滌懸液數次。

6. 將細胞沉淀重懸于培養基中。計數和接種細胞，進行培養。

分散酶

1. 使用無菌手術刀或剪刀，將組織切成 3-4 mm 的小塊。使用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液洗滌組織塊數次。

2. 加入分散酶（0.6 至 2.4 單位/ml，溶解在不含鈣和鎂的平衡鹽溶液中）。

3. 在 37°C 下孵育 20 分鐘至數小時。

4. 通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，將分散細胞和組織碎片與較大的組織塊分開。如果需要進一步 的解聚，在組織塊中加入新鮮的分散酶。

5. 通過離心在平衡鹽溶液中洗滌懸液數次。

為您的細胞類型選擇正確的膠原酶

分散酶

分散酶或中性蛋白酶是多粘芽孢桿菌產生的金屬酶?？焖佟睾偷姆稚⒚缚捎糜谑斋@和轉移正常的二倍體細胞和細胞系。分散酶可有效分離細胞團塊并從完整組織中分裂細胞，對膜完整性或活力幾乎沒有影響。

非酶細胞解離

Versene 溶液

Versene 溶液是 PBS 中的 EDTA 溶液，可溫和、非酶地解離細胞。這種螯合劑將某些細胞類型（如上皮細胞）從血管表面分離以進行懸浮。也可以用作胰蛋白酶消化前的洗滌劑。

非酶細胞解離緩沖液

推薦用于弱貼壁細胞（如上皮細胞），Gibco 細胞解離緩沖液可溫和解離并保持表面蛋白完整性。適合的應用包括參與配體結合的細胞、流式細胞和免疫組織化學研究。

無酶細胞解離緩沖液實驗方案：

以下是從基質中快速移取各種細胞系同時保持細胞完整性的一種常規程序。此程序并不普遍適用于所有細胞系。應根據經驗確定各系統的條件和濃度。 在傳代培養時，應定期監測細胞活力。細胞活力應大于 90%。

1. 使用前將所有試劑加熱至 37°C。

2. 去除細胞中的生長培養基。

3. 沖洗單層細胞，每個 T75 培養瓶或 100 mm 培養皿使用 5 ml 不含 Ca++ 和 Mg++ 的 PBS。輕輕搖動培養瓶（或培養皿），使溶液在室溫下將細胞洗滌30至60秒。吸出沖洗液并丟棄。

4. 重復步驟3。

5. 每個 T75 培養瓶或 100 mm 培養皿中加入大約 5 ml 細胞解離緩沖液，然后通過在室溫下搖動來輕柔地將細胞洗滌1至2分鐘。您可以在顯微鏡下觀察解離情況。 吸出溶液并丟棄。

6. 用手掌用力拍打培養瓶或培養皿，使細胞脫落。如果細胞不能快速脫附，則在室溫下再放置2至5分鐘，再次用手掌用力拍打培養瓶。對于貼壁能力更強的細胞（使用 5 ml 以上的解離緩沖液），可能需要重復此操作。細胞明顯脫附后，加入至少 5 ml 生長培養基。將細胞重懸于生長培養基中。

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