??1. 工作原理??

冷凍聚焦離子束顯微鏡（??Cryo-FIB??）是一種結合 ??聚焦離子束（FIB）加工?? 和 ??冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）樣品制備?? 的技術，主要用于對 ??冷凍生物樣品?? 或 ??敏感材料?? 進行納米級精密切削和成像。其核心工作原理如下：

??（1）冷凍樣品制備??

• 樣品通過 ??快速冷凍（如液氮冷卻）?? 形成玻璃態冰（Vitreous Ice），避免冰晶損傷。
• 冷凍樣品轉移至 ??Cryo-FIB?? 系統，保持 ??低溫（約 -140°C 至 -180°C）??，防止水蒸發或結構破壞。

??（2）聚焦離子束（FIB）加工??

• ??離子源（Ga? 或 He?/Ne?）?? 發射高能離子束（典型能量 ??30 keV??）。
• 離子束聚焦至 ??納米級束斑（5–10 nm）??，轟擊樣品表面，通過 ??濺射效應?? 去除材料。
• ??精確控制離子束掃描??，實現 ??薄片制備（<200 nm）?? 或 ??表面刻蝕??，用于后續冷凍電鏡（Cryo-EM）或冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）觀察。

??（3）電子束成像（可選）??

• 部分 ??Cryo-FIB/SEM?? 系統集成 ??掃描電子顯微鏡（SEM）??，可在加工過程中實時觀察樣品形貌（低劑量成像）。

??2. 系統構成??

Cryo-FIB 系統主要由以下關鍵模塊組成：

??（1）冷凍樣品傳輸與保持系統??

• ??冷凍樣品臺（Cryo-stage）??：保持樣品在 ??-140°C 至 -180°C?? 低溫環境。
• ??防污染冷阱（Anti-contamination Cold Trap）??：減少水汽凝結，避免樣品污染。
• ??冷凍傳輸裝置??：將樣品從冷凍制備設備（如 plunge freezer）安全轉移至 FIB 腔室。

??（2）離子束系統??

• ??離子源??：常用 ??鎵離子（Ga?）??，系統可選 ??氦離子（He?）?? 或 ??氖離子（Ne?）??，提供更高分辨率加工。
• ??離子光學系統??：靜電透鏡和偏轉線圈控制離子束聚焦與掃描。
• ??束斑控制??：可實現 ??5–100 nm?? 束斑調節，適應不同加工需求。

??（3）電子束成像系統（可選）??

• ??掃描電子顯微鏡（SEM）模塊??：低電壓（1–5 keV）電子束成像，減少樣品損傷。
• ??二次電子（SE）或背散射電子（BSE）探測器??：用于加工過程的實時監控。

??（4）氣體注入系統（GIS）??

• ??沉積氣體（如 Pt、C）??：用于 ??保護層沉積?? 或 ??修復損傷區域??。
• ??刻蝕氣體（如 XeF?）??：增強特定材料的離子束刻蝕效率。

??（5）控制系統與軟件??

• ??自動化切片軟件??：預設加工路徑，實現 ??自動薄片制備??（如 AutoSlice & View）。
• ??低劑量成像模式??：減少電子束對敏感樣品的輻照損傷。

??3. 技術優勢與挑戰??

??（1）優勢??

• ??保持樣品天然狀態??：冷凍環境避免水蒸發和結構塌陷，適用于 ??生物大分子、細胞、軟材料??。
• ??高精度加工??：納米級定位切削，制備 ??Cryo-EM 所需超薄樣品（<200 nm）??。
• ??多模態聯用??：結合 ??Cryo-SEM、Cryo-ET??，實現從加工到高分辨成像的全流程分析。

??（2）挑戰??

• ??冰污染風險??：樣品轉移過程中可能形成非晶冰，影響成像質量。
• ??離子束損傷??：高能離子轟擊可能導致樣品非晶化或成分改變（需優化束流參數）。
• ??設備復雜度??：需嚴格維持低溫、高真空環境，操作與維護成本高。

??4. 典型應用??

• ??結構生物學??：制備 ??冷凍電鏡（Cryo-EM）?? 樣品，解析蛋白質復合體或病毒結構。
• ??材料科學??：加工 ??鋰金屬負極、水凝膠?? 等敏感材料，研究界面或缺陷結構。
• ??細胞生物學??：對冷凍細胞進行 ??原位截面制備??，用于冷凍電子斷層掃描（Cryo-ET）。

??5. 未來發展方向??

• ??更低損傷離子源??：如 ??氦離子（He?）?? 替代 Ga?，減少樣品損傷。
• ??AI 輔助自動化??：智能識別感興趣區域（ROI），優化加工路徑。
• ??多束聯用平臺??：集成 ??離子束、電子束、X射線??，實現多維數據采集。

??6. 總結??

冷凍聚焦離子束顯微鏡（Cryo-FIB）通過 ??低溫離子束加工??，解決了傳統 FIB 對生物和敏感材料的損傷問題，成為 ??冷凍電鏡樣品制備?? 和 ??納米材料研究?? 的關鍵工具。其技術核心在于 ??低溫環境控制、高精度離子束切削?? 和 ??多模態聯用能力??，未來將進一步向 ??低損傷、智能化、高通量?? 方向發展。