FDH 在細胞甲醛代謝與癌癥耐藥研究中被高頻引用，實驗成敗往往取決于操作細節(jié)而非試劑本身。下面把一份 96 孔板實驗拆成 6 個關鍵節(jié)點，每個節(jié)點給出可落地的動作指令與常見故障排查，照著做能把板間 CV 壓到 5% 以下。

樣本制備：裂解液離子強度決定回收率

RIPA 高鹽配方（150 mM NaCl）會抑制 FDH 活性 20–30%，改用 50 mM Tris-HCl + 0.1% Triton X-100 可把回收率拉回 95%。細胞刮下來后先 PBS 洗兩遍，去掉培養(yǎng)基殘留的甲醛，再按 10? cells/mL 加入裂解液，冰上 15 min 后 12 000 g 離心 10 min，取上清立即上機或液氮速凍。裂解液里加 1 mM DTT 可穩(wěn)定酶活 48 h，但不要加 EDTA，它會螯合 FDH 所需的 Zn2?。

反應體系：乙醛替代甲醛為何更穩(wěn)

試劑盒說明書常寫“底物甲醛終濃度 5 mM”，實際操作中 37 °C 下甲醛揮發(fā)損失 10–15%，導致吸光度漂移。改用乙醛 2 mM 做替代底物，Km 值與甲醛接近，揮發(fā)可忽略，線性窗口從 10 min 延長到 30 min。NAD? 濃度固定在 1 mM，pH 9.0 的甘氨酸-NaOH 緩沖液能把 Vmax 推高 1.4 倍，適合低表達樣本。

板布局：空白孔、標準孔、抑制孔如何排布

• 空白孔：裂解液 + 緩沖液 + NAD?，無乙醛，用來扣背景

• 標準孔：純化 FDH 梯度 0–0.2 U/mL，做標曲

• 抑制孔：樣本 + 5 mM 甲酸鈉，驗證信號特異性

每塊板至少留出 4 個空白孔，分布在四角，避免邊緣效應。標準孔做雙列排布，一條用于實驗當天，另一條封膜 4 °C 保存 24 h 內(nèi)復測，驗證板間穩(wěn)定性。

讀板參數(shù)：振蕩延遲與雙波長校正

酶標儀設 340 nm 檢測 NADH 生成，動力學模式讀 5 min，間隔 15 s。加乙醛啟動反應后延遲 30 s 再開始讀數(shù)，讓液體表面張力穩(wěn)定。開啟 405 nm 參比波長，扣除氣泡或纖維蛋白造成的散射。若使用 384 孔小體系，把振蕩幅度降到 1 mm，防止液體飛濺。

故障排查：信號漂移與負值出現(xiàn)

信號漂移 90% 由揮發(fā)或溫度不均導致。把板蓋換成透氣膜，37 °C 預熱 5 min 再上機。出現(xiàn)負值通常是空白孔 OD 高于樣本孔，檢查空白孔是否誤加乙醛，或裂解液里混入了細胞碎片。重新離心 5 min 可解決。

數(shù)據(jù)換算：蛋白歸一與細胞歸一并用

一張 96 孔板跑完，先用 BCA 測每孔總蛋白，把 U/mL 轉(zhuǎn)成 U/mg。再用同一孔的細胞計數(shù)儀讀數(shù)，得到 U/10? cells。兩者比值可判斷樣本裂解效率：比值 <0.5 提示裂解不全，需延長裂解時間或加大 Triton 濃度。