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一、適用場景
乳膠微球表面帶有羧基功能基團，可通過EDC介導的化學反應與含有氨基的蛋白或多肽形成酰胺鍵，實現蛋白與微球的共價偶聯。
適用條件:
蛋白穩定性高、不易變性；
蛋白含氨基數量較少；
操作簡便，適合大規模生產。
二、基本原理
1.反應機制：
乳膠微球表面的羧基先與 EDC 反應生成活化的酯中間體，再與蛋白上的伯氨基反應生成酰胺鍵，實現共價偶聯。
2.反應環境：
pH 為4.5–6.0（弱酸性環境）。
3.注意事項：
若蛋白同時含多個氨基和羧基，過量 EDC 可能導致蛋白交聯失活，可使用羧基乳膠微球兩步法共價法偶聯蛋白調整方案。
三、注意事項
1. 緩沖體系：
禁用含氨基的緩沖液（如Tris緩沖液），推薦使用MES緩沖體系。
2. EDC適用規范:
防潮處理：使用前將EDC試劑瓶置于干燥器中升溫至室溫至少 30 分鐘，避免水汽進入。
現用現配：EDC 水溶液半衰期短，需臨用前配制。
3.抗體預處理：
抗體需不含 BSA 等蛋白類穩定劑及 Tris 等氨基緩沖鹽，若含此類成分，需通過離心脫鹽、超濾純化去除。
高比例甘油可能影響偶聯效率，建議預先去除。
四、基本流程（1 mg 蛋白偶聯至 10 mg 微球）
1. 配制緩沖液
反應緩沖液（R Buffer）：50 mM MES，pH 5.0（分出 2 mL 冰浴冷卻）。
封閉緩沖液（B Buffer）：50 mM HEPES，pH 7.4，1%（w/v）BSA。
儲存緩沖液（S Buffer）：50 mM HEPES，pH 7.4，1%（w/v）BSA，05%（w/v）Proclin® 300。
2. 微球預處理
將微球分散液混勻并平衡至室溫，按固含量取 10 mg 微球至 2 mL 圓底離心管，用 R Buffer 稀釋至1% w/v固含量。 例：若微球固含量為 10% w/v，取 1 mL 分散液 + 0.9 mL R Buffer；若為 5% w/v，取 0.2 mL 分散液 + 0.8 mL R Buffer。
3. 蛋白孵育
加入 1 mg 蛋白，顛倒混勻后，于 25℃混勻儀孵育 30 分鐘。
4. 配制 EDC 溶液
稱取 10–20 mg EDC 固體，用冰浴 R Buffer 溶解至濃度10 mg/mL（≈52 mM）。
5. 加入 EDC 溶液
按羧基總量的 5 倍摩爾比加入 EDC 溶液，充分混勻。 計算示例：若微球羧基密度為 100 μEq/g，10 mg 微球含羧基 1000 nmol，需 EDC 1500 nmol，對應 52 mM 溶液體積為 30 μL。
6. 反應與清洗
25℃混勻儀反應 2–4 小時，結束后 5000×g 離心 10 分鐘（若未沉淀，增大離心力或延長時間）。
棄上清，加 5 mL R Buffer 重懸沉淀，重復清洗 3 次。
7. 封閉反應
加 5 mL B Buffer 初步重懸微球，冰浴下用探頭式超聲破碎儀（功率 200 W，超聲 5 s / 間隙 5 s，總時長 10–15 分鐘）充分打散。
25℃混勻儀封閉反應過夜。
8. 儲存
離心棄上清，加 5 mL S Buffer 超聲打散，4℃保存備用（離心轉速和時間需根據微球粒徑調整）。
五、常見問題
Q1：如何選擇合適粒徑的微球？
線性范圍優先：選擇小粒徑微球（比表面積大，偶聯抗體量多）。
靈敏度優先：選擇大粒徑微球（凝集時粒徑變化顯著，濁度信號高）。
Q2：如何判斷微球是否打散？
方法：將微球用去離子水或 R Buffer 稀釋至 1% w/v（粒徑＞200 nm時稀釋至 0.05% w/v），測定 570 nm 吸光度（A0）。
對比：包被蛋白后，稀釋至相同濃度測定吸光度（A1）。若 A1接近或略高于 A0，說明已打散；若A1遠高于A0，可能為不可逆凝集，需降低微球濃度、調整EDC用量或改用兩步法。
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