在分子生物學研究中,雙熒光素酶報告基因檢測實驗因其高靈敏度、操作便捷和結果可靠,被廣泛應用于啟動子活性分析、miRNA靶基因驗證、轉錄因子功能研究等領域。然而,實驗過程中常常會遇到各種問題,例如熒光值異常、重復性差等,這些問題可能會影響實驗結果的準確性。為了幫助大家更好地掌握這一技術,我們整理了雙熒光素酶報告基因檢測實驗中的常見問題與解答,涵蓋了實驗設計、操作細節、數據分析等多個方面,希望這些內容助您輕松搞定實驗!
Q1:雙熒光素酶報告基因實驗可應用于哪些研究方向?
A1:①驗證microRNA同mRNA靶向互作;②驗證microRNA同lncRNA/circRNA靶向互作;③驗證轉錄因子與啟動子互作;④啟動子結構分析⑤啟動子SNP分析
Q2:如何選擇報告基因載體?
A2:螢火蟲熒光素酶基因和海腎基因(內參)在同一個載體上,選擇pmirGLO等載體;螢火蟲熒光素酶基因和海腎基因(內參)分別在一個載體上,可選擇pGL3/pRL系列載體;載體詳細信息可參考【干貨分享】手把手教你做雙熒光素酶實驗。
Q3:如何選擇主報告基因和內參基因的質粒比例?
A3:通常,主報告基因質粒與內參質粒的比例,建議作一個預實驗來調整(如螢火蟲載體與海腎載體比例分別用1:10、1:20、1:50、1:100),確保內參基因被準確檢測且不干擾主報告基因的表達。
Q4:如何保證檢測數據的有效性和真實性?
A4:①設立對照和重復:實驗中應設立陽性和陰性對照,以驗證實驗系統的有效性且需要做3個或3個以上復孔,并且引入另一個報告基因作為內參,主要是同批次樣品檢測值也可能出現浮動,排除多種干擾因素的影響(細胞狀態、轉染效率、載體質量、裂解速度、加樣精準度等)。②熒光值控制:熒光值過高可能會超出儀器的檢測范圍,導致無法檢測到值,一般建議將熒光值控制在5-6位之間。
Q5:熒光值過高或過低怎么辦?
A5:熒光值過高:可減少質粒轉染量,或對裂解產物進行稀釋后檢測;熒光值過低:可能是轉染效率低或裂解不充分,建議優化轉染條件、增加細胞量或延長裂解時間。
Q6:復孔間重復性差如何解決?
A6:確保樣本均一性,裂解后離心取上清檢測;定期校準移液器,保證加樣準確性;轉染時混合的力度/細胞量/時間等保持一致(同個數量級內的差異是可以接受的)。
Q7:雙熒光素酶檢測需要使用什么檢測板?
A7:建議使用全白板,優勢是靈敏度最高而且孔間相互干擾最小。
Q8:雙熒光素酶檢測需要使用什么儀器?
A8: 化學發光儀或帶化學發光檢測模塊的酶標儀。
Q9:海腎和螢火蟲是在同一個孔里面檢測嗎?能否分開檢測?
A9:同一個孔里檢測,不會相互影響,蘭博利德的海腎熒光素酶底物中有淬滅螢火蟲熒光值的物質。可以分開檢測,但是在一個孔里檢測會更加準確。
Q10:實驗過程有哪些注意事項?
A10:①樣品混勻:保證裂解產物與底物快速混合、混合時間一致,避免熒光素酶衰變的影響。②細胞裂解產物處理:細胞裂解產物常溫不超過6小時;-20℃一個月;-80℃半年。 ③反應體系:雙熒光素酶反應體系:20?μl(細胞裂解產物)、100?μl(螢火蟲熒光素酶底物)、100?μl(海腎熒光素酶底物),底物量可根據實際情況調整,但一定要保證底物過量,不然會造成檢測結果出現大的偏差。
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