Endothelial Rap1 restricts inflammatory signaling to protect from the progression of atherosclerosis.

Keywords: Cardiovascular disease, Endothelial function, Hemodynamics, Inflammatory signaling, Small GTPase Rap1

動脈粥樣硬化作為血管慢性炎癥疾病，其病理血管壁重塑源于內皮損傷引發的慢性炎癥，且內皮對血流模式的差異反應決定了斑塊的幾何定位。內皮連接機械傳感復合物中的 Rap1 是內皮機械傳感反應的關鍵成分，其缺失會損害 NO 釋放和內皮功能。Rap1 的兩種亞型 Rap1A 和 Rap1B 在調節整合素和鈣黏蛋白等方面發揮重要作用，對血管穩定、生成及內皮屏障調節很重要。分子層面，Rap1 通過調控 VEGFR2 信號等影響內皮功能。基于此，威斯康星州 Versiti 血液研究所的研究團隊對高膽固醇血癥小鼠模型中內皮 Rap1B 缺失的影響進行了研究，結果發現其雖不增加血管通透性，卻能增強細胞因子受體信號和 NF-κB 激活，揭示了 Rap1 通過限制促炎細胞因子信號維持內皮穩態的新機制。研究成果發表在Arterioscler Thromb Vasc Bio期刊題為“Endothelial Rap1 restricts inflammatory signaling to protect from the progression of atherosclerosis”。

首先，為了研究內皮細胞中 Rap1B缺失對載脂蛋白 E 缺陷（ApoE?/?）小鼠動脈粥樣硬化進展的影響，研究將Rap1iΔEC小鼠和對照小鼠分別與ApoE?/?小鼠雜交，生成Athero-Rap1BiΔEC和Athero-對照小鼠，喂食高脂肪西式飲食（HFD，21.2% 脂肪，0.2% 膽固醇 ）16周誘導高膽固醇血癥。結果發現，與正常實驗室飲食喂養的對照小鼠相比，Athero - 對照小鼠的血清膽固醇升高約 3 倍（圖 1A）。Athero-Rap1BiΔEC 小鼠的血清膽固醇也升高，但 Athero-Rap1BiΔEC 與 Athero - 對照小鼠的總膽固醇水平無差異（圖 1A）。在 HFD 處理結束時，用油紅 O 染色觀察動脈粥樣硬化病變，并在雄性和雌性小鼠的主動脈正面切片中量化斑塊面積（圖 1B）。Athero-Rap1BiΔEC  的動脈粥樣硬化病變面積顯著增加 ，且雌性小鼠病變更明顯（圖 1C ）。由于基礎內皮NO合成對預防動脈粥樣硬化進展至關重要，研究進一步給小鼠補充L-精氨酸，發現其能減少Athero-Rap1BiΔEC小鼠的斑塊形成（圖 1C ）。而在細胞實驗中，L-精氨酸處理雖能增加對照和siRap1B人主動脈內皮細胞的NO釋放，但siRap1B細胞的NO釋放量更低（圖 1D），且Rap1B缺陷會增加細胞對NO抑制劑的敏感性（圖 1E）。這些數據表明，NO生成缺陷是Athero-Rap1BiΔEC小鼠動脈粥樣硬化增強的潛在因素，證實了Rap1B在體內對動脈粥樣硬化進展的保護作用。

接下來，為了探究 Rap1 如何影響血流模式剪切應力相關的病理變化，研究人員對降主動脈（層流區域）和主動脈弓（紊亂血流區域）的斑塊進行量化分析。結果顯示，高脂飲食 16 周后，主動脈弓的動脈粥樣硬化斑塊積聚在升主動脈（AA）和降主動脈（DA）內曲率的 5 個區域，以及頭臂動脈（BCA）、左頸總動脈（LCC）和左鎖骨下動脈（LS）分支分叉的對側表面（圖 1F）。 與 Athero - 對照小鼠相比， Athero-Rap1BiΔEC 小鼠降主動脈（層流區）的病變面積顯著增加，而補充 L - 精氨酸可使其斑塊面積降至對照水平（圖 1G ）。在紊亂血流的主動脈弓區域，兩者斑塊面積無顯著差異，但 Athero-Rap1BiΔEC 小鼠在層流和紊亂流區域的平均斑塊體積均顯著增加（圖 1H） 。進一步研究發現，Athero-Rap1BiΔEC 小鼠主動脈根部的巨噬細胞密度顯著升高（圖 1J） ，表明炎癥反應增強。這些結果表明，內皮 Rap1B 通過不同機制在層流和紊亂血流區域發揮抗動脈粥樣硬化作用。

圖1    無論是否存在層流，內皮 Rap1B 缺失均會加劇動脈粥樣硬化斑塊沉積。

為了驗證 Rap1 缺失的內皮細胞中炎癥性 CAM 表達升高可能與白細胞募集增加相關假設，研究人員對 Athero - 對照和 Athero-Rap1iΔEC 小鼠主動脈弓切片進行熒光染色，原位檢測炎癥性 CAM 的表達（圖 2A，B）。結果發現 Athero-Rap1iΔEC 小鼠主動脈弓中 VCAM1 和 ICAM1 的表達較對照小鼠顯著增加（圖 2C，D），而基礎條件下 EC-Rap1 缺失并未引起 CAM 表達增加，Rap1iΔEC 和對照小鼠的 VCAM1 水平相似，且兩種小鼠中均未檢測到 ICAM1。此外，在細胞實驗中，TNF-α 處理 48 小時后，Rap1 缺失的 hAECs 中 VCAM1 表達明顯升高（圖 2E，F）。這些結果表明，內皮 Rap1 缺失會增強血管內皮對 TNF-α 的致動脈粥樣硬化反應，在促炎信號誘導的內皮 CAM 表達中發揮關鍵作用。TNF-α 除了通過誘導促炎轉錄發揮致動脈粥樣硬化作用外，還能通過引起血管屏障功能障礙的非轉錄機制發揮作用。為了探究體內 Rap1 缺失的內皮細胞屏障通透性增加的生理意義，研究人員檢測了 Athero - 對照和 Athero-Rap1BiΔEC 小鼠主動脈根部中BSA的外滲情況，發現在動脈粥樣硬化條件下兩者血管通透性無差異，脂多糖處理誘導急性炎癥時結果也相似。這些結果表明，Rap1 缺失會增加細胞黏附分子的轉錄，但不會增加血管通透性。

圖2    在缺乏層流的情況下，內皮細胞 Rap1 缺失會升高炎癥受體（CAM）的表達。

接著，研究人員檢測了主動脈弓中 NF-κB 的激活情況（圖 3A）。結果發現 Athero-Rap1iΔEC 小鼠主動脈弓內皮細胞中 NF-κB 的 p65 亞基核定位較 Athero - 對照小鼠顯著增加（圖 3B），表明其血管中 NF-κB 激活增強。在紊亂血流區域，NF-κB 和促炎蛋白轉錄的增加由 TNF-α 受體 TNFR1 介導，而 Athero-Rap1iΔEC 主動脈中 CAM 表達升高（圖 2C,D） 和 NF-κB 激活（圖 3B） 提示 Rap1 可能調控 TNF-α 誘導的激活過程。為了驗證這一假設，研究人員通過在缺乏層流的條件下研究了 TNF-α 對內皮細胞中 NF-κB 激活早期信號事件的影響 。在此條件下，TNF-α 刺激 hAECs 可導致 IκB 激酶（IKK）快速磷酸化，其下游的 IκB 在 Ser32/36 位點磷酸化，隨后 IκB 降解（圖 3C）。當 hAECs 缺失 Rap1 時，TNF-α 誘導的 IκB 磷酸化在刺激后2 分鐘即迅速升高（圖 3D）。  因此，siRap1 hAECs 中總 IκB 的變化呈瞬時性，與磷酸化依賴的 IκB 降解加速一致（圖 3C）。 與 Rap1 缺失下 IκB 磷酸化增強一致，TNF-α 誘導的 IKK 磷酸化在 Rap1 缺失的 hAECs 中較野生型對照顯著升高（圖 3D）。 綜上，Rap1 缺失可顯著增強 IKK 激活，加速 NF-κB 激活的早期信號事件。

圖3   在缺乏層流的情況下，Rap1 缺失會導致 NF-κB 激活增加。

TNFR 復合體的信號傳導可通過募集 PI3K 及其靶標 Akt 來增強，作為 TNFR 復合體的一部分，Akt 可磷酸化 IκB 和 IKK 以誘導 NF-κB 活性。先前研究表明 Rap1 參與上游 Akt 激活因子 PI3K 的調控，其可通過效應結構域與 PI3K 相互作用，通過構象改變和 PI3K 重定位促進 PI3K 激活。基于此，研究假設 Rap1 缺失時 PI3K-Akt 相互作用可能被干擾，導致 NF-κB 激活增加。

為了驗證上述假設，研究人員在 Rap1 缺陷和對照 ECs 中，使用 Akt1/2 選擇性抑制劑 AKT inhibitor VIII 處理后檢測 TNF-α 誘導的 IKK 和 IκB 磷酸化（圖 4A）。結果顯示 TNF-α 處理未導致 Akt 磷酸化升高，而 AKT inhibitor VIII 處理使 WT 和 siRap1 ECs 中 Akt-Ser473 磷酸化顯著降低（圖 4B），且該抑制劑不改變 WT hAECs 中 IκB 或 IKK 的磷酸化，卻能降低 siRap1 hAECs 中 TNF-α 誘導的過度 IκB 和 IKK 磷酸化至 WT 水平（圖 4C,D）。這些結果表明，限制 Rap1 缺陷細胞中的 Akt 活性可恢復 ECs 對 TNF-α 的正常反應，提示 Rap1 通過限制 Akt 介導的 IKK 激活來抑制 TNF-α 誘導的 NF-κB 激活信號。

圖4    在缺乏層流的情況下，Rap1 通過抑制 Akt 來限制向 NF-κB 的炎癥信號傳導。

圖5    內皮 Rap1 通過不同的機制在存在和缺乏層流的情況下預防動脈粥樣硬化。

總之，該研究確定了 EC 穩態的新機制，內皮 Rap1 在存在和缺乏層流的情況下均可抑制動脈粥樣硬化進展：在層流中，Rap1 刺激 NO 釋放起主要作用；在缺乏層流時，限制促炎信號傳導起主要作用。Rap1 抗動脈粥樣硬化功能（圖5）為內皮穩態和 CVD 進展的機制提供了新的見解。

參考文獻：Singh B, Kosuru R, Lakshmikanthan S, Sorci-Thomas MG, Zhang DX, Sparapani R, Vasquez-Vivar J, Chrzanowska M. Endothelial Rap1 (Ras-Association Proximate 1) Restricts Inflammatory Signaling to Protect From the Progression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021 Feb;41(2):638-650. doi: 10.1161/ATVBAHA.120.315401. Epub 2020 Dec 3. PMID: 33267664; PMCID: PMC8105264.

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