一、實驗準備

hPSC誘導分化內耳類器官試劑盒（abs90132-1kit）

產品組成：

2、輔助試劑

3、實驗耗材

 二、誘導流程圖

三、試劑盒使用流程

①EB 形成（2 天）
1、hPSC 于基質膠包被的六孔板的一個孔，用Advance 人多能干細胞培養基培養增殖至 70-80%匯合度。
2、吸去Advance 人多能干細胞培養基。
3、孔中加入 1mL PBS（無鈣鎂離子）洗，吸去。
4、孔中加入 1mL 人多能干細胞消化液，37℃消化 3min。
5、將 20mL EB 形成培養基和 40μL EB 形成補充劑混合均勻獲得 EB 形成wan全培養基。（注意：所用培養基均應提前在工作臺放置 30min 以恢復室溫，后面操作同理。）
6、消化完成后于顯微鏡下可看到克隆發白發亮。
7、吸去 人多能干細胞消化液，每孔加入 1mL EB 形成wan全培養基終止消化。
8、輕輕吹打孔內細胞 2-3 次，將 500uL 細胞懸液移至有 9mLEB 形成培養基的 15mL 離心管中。
9、100g 離心 5min，吸棄上清。
10、輕彈細胞沉淀液，加入一毫升 EB 形成wan全培養基重懸細胞，將細胞懸液加入 9mLEB 形成wan全培養基，重新制成細胞懸液。
11、將細胞懸液移至加樣槽，使用多通道移液器種到超低吸附 96 板中，每孔 100μL，接種 96個孔，普通 96 孔板每孔加 100μL PBS，96 孔作為配平。
12、于低速水平離心機，850rpm/120g 離心 3min，將板放入 37℃，5%CO₂ 的培養箱，記為 D-2。
13、第 2 天(D-1）可以看到形成大小均一的 EB。每孔補充 100μL EB 形成培養基（不含補充劑），放入 37℃，5%CO₂ 的培養箱。
（注意：補充 EB 形成培養基后，可將多通道移液器槍頭置于液面下輕輕吹打，在不影響到 EB的情況下混勻培養基。）

②EB 分化階段（12 天）
14、D0，解凍補充劑 A，9.6mL 預冷的基礎培養基 1 與補充劑 A、200μL Matrigel 混合均勻，恢復至室溫后，按每孔 100μL 更換培養基，誘導 EB 分化，用多通道移液器輕輕吹打，使 EB懸浮。在 37℃，5%CO₂ 培養箱中培養 4 天。
15、D4，解凍補充劑 B，2.5mL 基礎培養基 1+補充劑 B 混合均勻，按每孔 25μL，加到 96 孔板中，并輕輕移液 8-10 次混勻，使每孔培養基的終體積為 125μL，37℃，5%CO₂ 培養 4 天。
16、D8，解凍補充劑 C，2.5mL 基礎培養基 1+補充劑 C 混合均勻，按每孔 25μL，加到 96 孔板中，并輕輕移液 8-10 次混勻，使每孔培養基的終體積為 150μL，將 96 孔板放回培養箱，37℃，5%CO₂ 培養 4 天。

③耳泡形成階段（6 天）
17、D12，EB 誘導結束，準備好基礎培養基 2（提前在冰上冷藏至少 30min）；或者，在 D11 上使基礎培養基 2 存儲在 4°C 過夜。Matrigel 提前與補充劑 D 于 4℃解凍，冷的基礎培養基 2 與補充劑 D 混合均勻。將 200uL Matrigel 加入 20mL 冷的混合培養基中，反復吹打溶解 20 次，復溫到室溫。將 96 孔板中的聚集物轉移到兩個 100mm 培養皿中，每個培養皿中有 48 個聚集體。用 1-2mL 的 PBS 洗滌聚集體 2 次，再用 1mL 不含 Matrigel 的混合培養基洗滌 1 次，然后分別加入 10mL 含 Matrigel 的混合培養基，將培養皿放入培養箱中，37℃，5%CO₂ 培養 3天；D15 吸掉培養皿中的培養基，重新加入不含 Matrigel 的混合培養基，繼續培養 3 天，誘導
耳泡形成；
（注意：10mm 皿一般換液需要 10mL 培養基）

④內耳類器官成熟階段（42 天）
18、D18-60，內耳類器官逐漸成熟，將培養基換成成熟培養基，開始長期培養，每 5 天換一次液，到 60 天左右獲得具有感覺毛細胞的成熟內耳類器官。

三、內耳類器官鑒定圖

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