Christian R. Good; Alistair White; Joao Brandao; Simon Jackson

◆摘要

目前用于檢測水體糞便污染的方法依賴于糞便污染指示菌（FIB，大腸桿菌和腸球菌）的培養，該方法需要24~48 h，或導致預防措施的延遲，并對公共衛生構成威脅。因此，我們需要更快速的檢測方法。在本研究中，我們測試了一種快速便攜的檢測方法——Bacterisk。該方法可在30 min內檢測出細菌生物標志物內毒素，從而定量檢測水樣中的細菌生物量。我們同時評估了159個沿海水樣，并將結果與傳統的FIB培養進行比較。

Bacterisk檢測法的內毒素風險（ER，Endotoxin Risk）數據與FIB培養結果之間存在明顯的相關性，根據歐盟浴場水質指令的數值能準確區分劣質、良好和優質的浴場用水。根據受試者工作特性曲線（ROC）確定適用于沿海水樣檢測的推薦ER閾值，曲線下面積為0.9176，p值為0.0001。推薦閾值為7,300 ER單位，靈敏度為95.45%，特異性為 83.48%。結果顯示，Bacterisk檢測法是一種快速、易用的原位評估浴場用水水質的方法。

本文亮點

l 分析了多份沿海水樣

l 使用了新開發的水質快速評估方法（Bacterisk）

l Bacterisk檢測法的結果與傳統培養方法顯示高相關性

l Bacterisk檢測法提供了一種可快速評估海水浴場水質的方案

關鍵詞：Bacterisk、海水浴場水質、內毒素、糞便指示菌、公共衛生、快速方法

◆引言

水上娛樂活動對身心健康至關重要（Overbury et al. 2023），此類活動帶來的旅游效應也為當地經濟帶來了巨大收益。歐洲人每年在開放水域上娛樂旅游的花費超8000億歐元（B?rger et al. 2021）。但不幸的是，污水排放和農業徑流等各種來源的微生物污染對公眾健康構成重大威脅。與不游泳的人相比，游泳者出現胃腸道疾病、呼吸道感染、皮膚感染、耳部和眼部感染等癥狀的風險要高出3.3倍（Leonard et al. 2020），與廢水相關的抗微生物耐藥性的增加也進一步加劇了感染風險（Fouz et al. 2020）。此外，水質是游客選擇旅游目的地的主要原因（(Dodds & Holmes 2018），水質不佳的印象可能會導致歐洲每年損失約1000億歐元的收入（B?rger et al. 2021）。 因此，監測海水浴場水質對于降低娛樂用水的健康風險、改善公眾對水質的印象和信心至關重要。

利用糞便指示菌（FIB）可監測沿海水質是否受到糞便污染，常用的指示菌是大腸桿菌和腸球菌。這些細菌一般存在于包括人類在內的溫血動物的腸道中，而當這些細菌出現在水中時，就表明水質受到了糞便污染。大多數FIB并不致病，但它們能證明水中存在糞便污染，這可能是沙門氏菌、志賀氏菌、梭菌、軍團菌、耶爾森氏菌、結核桿菌、腺病毒、諾如病毒、輪狀病毒和冠狀病毒（Motlagh & Yang 2019）、寄生蟲和真菌物種（Shah et al. 2011）等致病菌的潛在來源。使用FIB作為其他潛在危害性更大的病原體的替代物，無需進行多次檢測，從而節省了資源。

歐盟目前通過監測大腸桿菌和腸道腸球菌（《浴場水質指令》，BWD，2006/7/EC）對浴場用水水質進行監管，并根據水域中這些指標細菌的含量（表1），每年將水域劃分為 “優秀”、“良好”、“合格”或 “不合格”四級（Bathing Water Regulations 2013）。

表1

沿海和過渡水域標準

a：基于95百分位數

b：基于90百分位數

基于培養的FIB計數方法是目前的金標準，自20世紀中期起一直使用至今（Dufour 2021）。雖然這些方法已經非常成熟，但它們也有幾個主要缺點。顯著的問題是，這些方法需要至少18~44 h的時間來培養微生物，這意味著獲得的任何結果具有滯后性，無法及時采取措施來解決有關污染水域的問題。此外，目前的方法需要將樣本運送到專門的實驗室，還需要專業人員使用可重復的方法來進行操作。由于只聚焦于FIB，可能無法檢測出其他不一定屬于糞便性質的病原體（Topi? et al. 2021）。目前的方法存在的缺點證明，我們不僅需要更快速的解決方案，還需要更全面的解決方案，以便指示更多的病原體。

一些研究人員認為，內毒素可能是快速確定細菌生物量和水質的有效生物標志物（Jorgensen et al. 1973; Watson et al. 1977; Evans et al. 1978; Jorgensen et al. 1979; Haas et al. 1983）。內毒素是存在于革蘭氏陰性菌和某些藍藻外膜中的脂多糖，我們團隊之前的研究表明，由于天然腸道微生物群和污水排放（Sattar et al. 2013）中存在高濃度的革蘭氏陰性菌（尤其是大腸菌群），所以可使用內毒素作為海水（Sattar et al. 2013）和地表水（Sattar et al. 2022）的糞便污染標志物。Molendotech團隊開發了一種便攜式實時檢測水中內毒素的試劑盒（Bacterisk），即使是非專業人員也可以在現場進行操作。

本研究旨在評估Bacterisk檢測法作為快速風險評估工具的性能，以評估英格蘭西南部沿海和內陸浴場水域的水質。為此，我們同時使用傳統的培養方法和Bacterisk方法檢測FIB、大腸桿菌和腸道腸球菌。

◆所需材料和方法

采集水樣

根據《Bathing Water Regulations》（2013年），我們在英格蘭西南部的不同地點共采集了 159 份沿海和過渡水域樣本。使用無菌瓶在水面下30 cm、至少1 m深的水中采集500 mL樣品，避光運輸，并在4 h內進行檢測；或將樣品儲存在冰箱中（2-8 ℃），并在采集后24 h內進行檢測。

膜過濾

使用6分支真空濾膜架（Sartorius, UK），通過0.45 μm濾膜（Whatman, UK）對每種水樣（1、10 和100 mL）進行無菌過濾。將濾膜置于膜乳糖葡萄糖醛酸瓊脂（MLGA）（Oxoid, UK）上，在30 ℃下培養4 h后，再在37 ℃下培養14 h，以檢測推定的大腸桿菌；或置于Slanetz和Bartley培養基（Oxoid,UK）上，在36 ℃下培養44 h，以檢測推定的腸道腸球菌。然后計算菌落形成單位（CFU）的數量，并以CFU/100 mL表示。

細菌檢測

按照廠家的說明進行Bacterisk檢測（Molendotech Ltd, Brixham, UK; www.bacterisk。。ｃｏｍ）。以 1:100 的比例在緩沖液中稀釋樣品，然后與等體積的檢測試劑在無內毒素的微量比色皿中混合，最終體積為200 μL。隨后使用集成的Bacterisk孵育器和讀數器，樣品在37 ℃下孵育25 min，根據樣品在405 nm處檢測吸光度計算內毒素風險（ER）評分。部分樣品可使用Biotek ELx808酶標儀（Agilent）進行孵育和讀數，以提高通量。每次檢測都需要設置一個陰性對照（無內毒素水）和一個陽性對照（大腸桿菌055:B5的內毒素）。

凝膠法檢測

按照制造商提供的說明書，通過動態顯色鱟試劑（LAL）法檢測內毒素活性（EU/mL）。

統計分析

使用 GraphPad Prism Ver.9（Windows版）、GraphPad Software, Boston, Massachusetts, USA（www.graphpad。。ｃｏｍ）通過Fisher精確檢驗和卡方檢驗對樣品分布以及Bacterisk檢測法數據與培養水質之間的相關性進行統計分析。

結果

Bacterisk檢測法通過測定樣本中內毒素濃度，將其量化為內毒素風險單位（ER）——該單位為基于終點法試劑顏色變化的相對標度。如前所述 （Sattar et al. 2022)，ER與使用動力學鱟試劑 (LAL) 檢測法測定的內毒素活性 (EU/mL) 直接相關，當ER達到10,000 時，Bacterisk檢測法開始飽和并失去線性關系 (圖1)。

圖1

四參數擬合的標準曲線顯示內毒素活性（EU/mL）與ER之間的相關性。R2 = 0.9892。每個點代表三次獨立實驗的平均值±平均值的標準誤差。

本次共對159個沿海及過渡區水樣同時進行分析，使用Bacterisk檢測法計算ER，并使用膜過濾法計算大腸桿菌和腸道球菌（CFU/100 mL）的含量。根據大腸桿菌（CFU/100 mL）含量，將樣品進一步分為“良好/合格”和“不合格”兩組水質。根據《浴場水質指令》，BWD，2006/7/EC，水質“不合格”的閾值設定為>500個大腸桿菌CFU/100 mL。根據此閾值，共計有107個“良好或合格”的樣品，其ER中值為3,696，25和75百分位數分別為2,219和6,108；另有52個“不合格”樣本，ER中值為12,475，25和75百分位數分別為8,827和20,316。雖然腸道球菌也被視作FIB，但由于它們是革蘭氏陽性菌，所以并非用于對水樣進行分類，而是用于了解腸道球菌與ER之間是否存在相關性。

雖然Bacterisk的檢測結果可用于獲得區分不同水質水平的風險組，但在此我們將其用作二元分類模型，以確定水源是被污染的（“不合格”）還是清潔的（“良好或合格”）。檢查此類模型性能的推薦方法之一是繪制受試者工作特性曲線（ROC），然后利用該曲線確定用于區分兩組水質的最佳閾值ER值。以1-特異性作為x軸，計算公式如下：

以靈敏度（真陽性）為y軸，計算公式如下：

通過繪制每個Bacterisk值的點，ROC曲線可以直觀地區分Bacterisk檢測法整個結果范圍內的清潔樣品和污染樣品，該方法將每個結果視為一個具有其靈敏度和特異性的閾值，然后通過選擇Youden指數最高的閾值來確定最佳閾值。Youden指數是衡量整體診斷有效性的統計數據（Youden 1950），計算公式如下：

通過ROC曲線可計算出一個介于0和1之間的曲線下面積值（AUC值）。AUC值越接近1，模型在預測正確分類方面的性能越好。而AUC值為0.5表示模型沒有預測正確分類的能力，AUC值大于0.8的模型被認為是可接受的（Nahm 2022）。ROC分析確定AUC值為0.9176，p值小于0.0001（圖2）。Youden指數分析確定閾值≥7,300（Youden 指數=0.7893），對應于95.45%的靈敏度和 83.48%的特異性。

圖2

Bacterisk檢測法判別沿海和過渡區水樣中是否存在污染的ROC 曲線（AUC = 0.9176，Youden指數 = 0.7893）。AUC 為ROC曲線下面積。

在確定Bacterisk檢測法檢測的靈敏度和特異性后，根據水樣的ER結果與大腸桿菌和腸球菌培養結果作圖。使用歐盟指令中規定的大腸桿菌閾值（>500 CFU/100 mL）來區分“良好或合格”的浴場水質與“不合格”的浴場水質，獲得了 Bacterisk檢測法結果與大腸桿菌結果之間的相關性，腸球菌也獲得了相同的相關性（圖3）。將ER閾值（≥7,300 ER）和FIB閾值（腸球菌 >200 CFU/100 mL）應用于圖3，可以繪制一個象限，并將結果區分為真陽性 (TP) 和真陰性 (TN)。此外，Bacterisk檢測法檢測結果為“陽性”但培養結果為陰性的樣本，會被標記為“脫靶陽性”（OP），這是由于存在其他革蘭氏陰性菌或潛在可存活但不可培養細菌（VBNC）產生的高濃度內毒素所致；而Bacterisk檢測法檢測結果為陰性但培養結果為陽性的樣本，會被標記為“假陰性”（FN）。在44份培養陽性樣本中，有兩份被Bacterisk檢測法檢測為陰性，假陰性率為4.5%（相比之下，Colilert-18^® 的假陰性率為7.4% (Tiwari et al. 2016），計算公式如下：

圖3

散點圖顯示了使用膜過濾法計數的Bacterisk ER對 (a) 大腸桿菌和 (b) 腸道腸球菌的檢測結果。該圖根據ER閾值（X 軸 7,300）以及 (a) 大腸桿菌閾值（Y 軸 >500 CFU/100 mL）和 (b) 腸球菌閾值（Y 軸 >200 CFU/100 mL）分為四個象限。N=159；TN：true negative（真陰性）；TP：true positive（真陽性）；FN：false negative（假陰性）；OP：off-target positive（非目標陽性）。

在分析的 159 個水樣中，Bacterisk ER結果與大腸桿菌和腸球菌培養結果之間有很強的一致性（TP 大腸桿菌=42；TP 腸球菌=46；TN 大腸桿菌=94；TN 腸球菌=91；OP 大腸桿菌=21；OP 腸球菌=17；FN 大腸桿菌=2，FN 腸球菌=5）。

根據ER閾值制作了列聯表，并使用Fisher精確檢驗進行了分析，以檢查樣品的分布以及所選閾值與兩類水質之間的相關性（表2），結果顯示，ER取決于水質狀況（p < 0.0001）。

表2

沿海和過渡水域閾值列聯表

不合格是指每100 mL樣品中的大腸桿菌含量>500個，合格或良好是指每100 mL樣品中的大腸桿菌含量≤500個。Fisher精確檢驗p值≤0.0001。

為了進一步提高水樣在各個水質類別中的表征準確度，我們設置了三個風險組，并設定了不同的風險比閾值。根據水樣被歸類為“不合格”的可能性，這三個風險組分別被劃分為低、中、高三個風險組，其中低風險組采用ROC分析確定的原始閾值。將三個風險組放入列聯表（表3）中，并使用卡方檢驗進行趨勢分析（X2 = 88.93，自由度=1，p值≤0.0001。

表3

沿海和過渡水域風險組的列聯表

不合格是指每100 mL樣品中的大腸桿菌含量>500個，合格或良好是指每100 mL樣品中的大腸桿菌含量≤500個。趨勢卡方檢驗 X2(1) = 88.93, p 值<0.0001。

◆討論

沿海水域的糞便污染會損害水質、加速傳染病在人類和海洋生態系統之間傳播，對健康構成嚴重威脅。沿海游泳者的患病率是非游泳者的3.3倍（Leonard et al. 2020），水質不佳的印象會對經濟產生不利影響（B?rger et al. 2021）。因此，有效監測糞便污染對于保護人類健康、防止或減輕糞便污染向海洋蔓延以及恢復公眾信心至關重要。

目前，檢測水體糞便污染的常規方法是檢測指示菌：大腸桿菌和腸球菌。而檢測需要將水樣運送到符合標準的實驗室，由專業人員對樣品進行過濾、培養、生化檢測和鑒定，通常需要18~44 h才能得到結果。因此，得到的結果具有滯后性，不利于針對污染水體采取積極主動的措施。雖然這種方法可以用于了解指定浴場在一段時間內的風險概況，但無法提供當前水質的信息。考慮到FIB的水平全天都在發生變化，常規方法具有很大的局限性（Kim et al. 2009）。

我們小組此前的研究表明，內毒素可作為海水（Sattar et al. 2013）和地表水（Sattar et al. 2022）糞便污染的標志物。Bacterisk檢測法可檢測細菌生物標志物內毒素，它的開發是為了解決目前基于培養的檢測方法的局限性。此方法便于攜帶，可在30 min內得出結果，從而實現近乎實時的水質監測，有利于日常海灘管理決策收集信息。此外，它還可以在重大社會活動之前，通知公眾水質是否適合游泳（WHO 2018）。

Bacterisk檢測法通過“ER”單位來衡量內毒素含量，此單位與內毒素數量呈精確對應關系。本研究結果表明，Bacterisk檢測法可有效監測沿海水質，且檢測結果與FIB大腸桿菌和腸球菌的含量水平存在顯著相關性。與腸球菌（一種不含有內毒素的革蘭氏陽性菌）的顯著相關性也令人意外，但很可能反映了同樣存在于糞便污染中的革蘭氏陰性菌的檢測。ROC分析確定了沿海和過渡水樣本的優化ER閾值為≥7,300，對應的靈敏度為95.45%，特異性為83.48%。使用該閾值，我們發現Bacterisk檢測法ER值與大腸桿菌或腸球菌的存在具有顯著相關性。在分析大腸桿菌時，60.38%的樣本被歸類為“良好或合格”,26.42%被歸類為“不合格”。在所有樣本中,11.95%的樣本被Bacterisk檢測法檢測為陽性，但培養結果為陰性（“OP”）。這是由于Bacterisk檢測法檢測出了革蘭氏陰性細菌產生的高水平內毒素，或處于VBNC狀態的革蘭氏陰性細菌。VBNC 細菌的問題會導致評估海水浴場水質時會明顯低估活菌數量，產腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic E. coli）在應激條件下會進入VBNC狀態，但在海水和淡水中的長期培養后仍具有傳染性（Lothigius et al. 2010）。因此，這種VBNC狀態會對任何以大腸桿菌計數作為水質指標的檢測方法的準確性產生負面影響。而Bacterisk檢測法不僅能警示VBNC細菌的存在，還能檢測其他潛在病原體，例如發現在當前指標檢測方法中被歸類為“良好”的游泳水中的沙門氏菌屬（Mansilha et al. 2010）等。同樣，像嗜水氣單胞菌屬（Aeromonas ssp.）這樣的病原體，其性質不一定是糞便性的。目前的方法無法直接檢測或作為替代指標檢測（Janda & Abbott 2010），但Bacterisk檢測法可以通過檢測其內毒素表達而檢測到這些病原體（Maga?a et al. 2013）。

內毒素也可能來源于非致病性細菌。然而數據顯示，對于“良好或合格”類別，觀察到中位數ER值為3,696，而“不合格”類別為12,475，其中位數和四分位數值分別為2,219和6,108，分別對應"良好或合格” 類別，而“不合格”類別的第25和第75百分位數值分別為8,827和20,316。這表明，在沿海和過渡性水域中檢測到了來自革蘭氏陰性菌的內毒素背景水平。我們觀察到內毒素水平的顯著增加僅發生在污染事件期間，而不是由正常微生物群落的波動導致。

在159份檢測樣品中，有2份經Bacterisk檢測法檢測為陰性，但經培養檢測為陽性，假陰性率為4.5%。這些假陰性結果可能是由于表面活性劑、螯合劑或高濃度重金屬離子的存在導致內毒素聚合體被破壞（Gorman & Golovanov 2022），從而導致了內毒素回收率低的現象。除特殊情況外，Bacterisk檢測法采用專門優化的100倍樣品稀釋以規避這一問題（Milton et al. 1992）。值得注意的是，目前的標準方法Colilert-18^®在測試芬蘭的浴場水域時顯示其假陰性率為7.3%（Tiwari et al. 2016），因此Bacterisk檢測法的假陰性率更低。

值得一提的是，目前許多用于選擇性分離和計數大腸桿菌的參考方法都依賴于檢測β-D-葡糖醛酸酶，如發色性瓊脂（MLGA、MI 和 Chromocult Coliform^®）和Colilert^®的不同配方（特別是Colilert-18^®）。由于人類糞便中高達34%的大腸桿菌菌株（Chang et al. 1989）和從環境中分離的10-20%的大腸桿菌菌株（Shadix & Rice 1991）不含或僅含有較低水平的β-D-葡糖醛酸酶，因此依賴檢測β-D-葡糖醛酸酶會導致假陰性率過高。此外，由于在本研究中使用MLGA來確定推定大腸桿菌的數量，因此被歸類為 “OP ”的Bacterisk檢測法結果實際上可能是真陽性。因此，由于所有大腸桿菌菌株無論其β-D-葡萄糖醛酸酶活性如何都能表達內毒素，因此可使用Bacterisk檢測法進行檢測。

◆結論

綜上所述，已經證明Bacterisk檢測法提供了一種快速、簡便的原位評估海水水質的方法。Bacterisk檢測法的檢測結果與傳統的FIB培養結果在統計學上具有明顯相關性，這使我們有信心將Bacterisk檢測法用作沿海海水水質的快速篩查工具。據估計，歐洲旅游業每年因水質差造成的損失約1000億歐元，因此改善基礎設施和檢測對增強公眾對浴場水質的信心至關重要。清潔的娛樂用水所帶來的經濟和健康價值，以及對污染企業創紀錄的罰款，激發了人們對新型快速檢測解決方案的需求，用于監測和評估海水浴場的風險。通過提供近乎實時的水質評估，Bacterisk檢測法可讓監管機構和負責浴場水質的公司能夠立即采取行動，保護公眾健康和環境。

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