一、背景

大鼠真皮成纖維細胞分離自大鼠皮膚組織采用酶解法制備而來，波形蛋白（vimentin）免疫熒光染色呈陽性，細胞純度可達90%以上，且不含有hiv-1、hbv、hcv、支原體、細菌、酵母和真菌等。

真皮主要由成纖維細胞及其產生的纖維、基質構成，并有血管、淋巴管、神經、皮膚附屬器及其他細胞成分。該細胞主要分布于黏膜和皮下疏松結締組織，胞質內富含嗜堿性顆粒，細胞表面能夠表達高親和力fcεri，可結合游離ige，參與i型超敏反應。

大鼠真皮成纖維細胞多呈長梭形，具有突起，細胞胞體較大，胞質弱嗜堿性，胞核較大呈橢圓形，染色質疏松色淺，核仁明顯。剛分離的大鼠真皮成纖維細胞呈圓形，較亮，培養40min左右貼壁，12～24 h左右伸展，36～48h進入對數生長期。分離純化3d后接近融合，并彼此連接成網狀。

二、細胞操作

1、取出25cm2培養瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細胞培養箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩定細胞狀態。

2、待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養。

3、細胞傳代

1)吸出25cm2培養瓶中的培養基，用PBS清洗細胞一次；

2)添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入培養液終止消化；

3)用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當的比例進行接種傳代，然后補充新鮮的培養基至5mL，放入37℃，5%CO2細胞培養箱中培養；

4)待細胞貼壁后，培養觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的培養基。

三、應用

用于十全大補湯配伍不同劑量肉桂對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞的影響研究：

探討十全大補湯配伍不同劑量肉桂對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞的調節作用,從細胞水平研究十全大補湯配伍不同劑量肉桂對氧化應激介導的慢性難愈性創面的作用機制。

方法：采用原代培養組織塊法獲得大鼠真皮成纖維細胞。采用十全大補湯原方及調整肉桂劑量所得的三組方藥灌胃Wistar大鼠,制備5組不同的含藥血清,分別為正常對照組、去肉桂組、原方組、2倍肉桂組及4倍肉桂組。采用一定濃度的H2O2刺激大鼠真皮成纖維細胞,制備細胞氧化損傷模型。用各組大鼠血清對氧化損傷的大鼠真皮成纖維細胞實施干預,采用MTT法檢測四組藥物對氧化損傷的大鼠真皮成纖維細胞增殖的影響；采用PI單染法和PI/Annexin V雙染法結合流式細胞術檢測四組藥物對氧化損傷的大鼠真皮成纖維細胞周期和凋亡的影響；采用DCFH-DA探針和JC-1探針結合流式細胞術檢測四組藥物對氧化損傷的大鼠真皮成纖維細胞細胞內活性氧水平和線粒體膜電位的影響。

結果：1、濃度在100-1000umol/L范圍內的H202刺激大鼠真皮成纖維細胞30min,可明顯抑制細胞增殖,細胞增殖抑制率（IR）隨H202濃度增高而依次增高。當H202濃度為500umol/L時,IR約為50%,可作為誘導細胞氧化損傷的合適濃度。

2、500umol/L H2O2刺激大鼠真皮成纖維細胞30mmin后,MTT法測得的OD值明顯降低；GO/G1期細胞比例明顯增高,S期和G2/M期細胞比例明顯降低；細胞凋亡率明顯增高；線粒體膜電位明顯降低；細胞內活性氧水平顯著上升。

3、MTT法檢測細胞增殖結果中,氧化損傷的大鼠真皮成纖維細胞給予藥物干預24h后,10%血清濃度組中2倍肉桂組和4倍肉桂組OD值升高；15%濃度組中2倍肉桂組OD值明顯升高。藥物干預48h后,5%濃度組中2倍肉桂組和4倍肉桂組OD值明顯升高；10%濃度組中2倍肉桂組OD值明顯升高。在四個用藥組中,2倍肉桂組在兩個時間點上的OD值均為。

4、細胞周期檢測結果中,氧化損傷的大鼠真皮成纖維細胞給予藥物干預24h后,四個用藥組G0/G1期細胞比例均顯著降低,S期和G2/M期細胞比例均顯著增高。藥物干預48h后,原方組、2倍肉桂組和4倍肉桂組G0/G1期細胞比例降低,S期和G2/M期細胞比例增高。在四個用藥組中,2倍肉桂組在兩個時間點上的細胞增殖指數均為。

5、細胞凋亡檢測結果中,氧化損傷的大鼠真皮成纖維細胞給予藥物干預24h及48h后,四個用藥組細胞凋亡率均明顯降低。在四個用藥組中,2倍肉桂組在兩個時間點上的細胞凋亡率均為。

6、線粒體膜電位檢測結果中,氧化損傷的大鼠真皮成纖維細胞給予藥物干預24h后,只有2倍肉桂組明顯提高了線粒體膜電位。藥物干預48h后,四個用藥組對線粒體膜電位無明顯影響。

7、活性氧檢測結果中,氧化損傷的大鼠真皮成纖維細胞給予藥物干預24h及48h后,四個用藥組活性氧水平均顯著降低。

結論：十全大補湯配伍不同劑量肉桂可以通過促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、清除細胞內活性氧的途徑,對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞起到保護作用。

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