cEND 細(xì)胞系的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)

細(xì)胞系的建立背景

永生化小鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 (cEND) 細(xì)胞系的建立，旨在為血腦屏障相關(guān)的研究提供一個(gè)穩(wěn)定且可靠的體外模型。該細(xì)胞系通過(guò)特定的技術(shù)手段，如使用含有 polyoma 中間 T 抗原的復(fù)制缺陷型病毒進(jìn)行永生化處理，從而克服了原代細(xì)胞培養(yǎng)中存在壽命短、難以傳代等問(wèn)題，為長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究提供了可能。

細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)特性

cEND 細(xì)胞在形態(tài)上呈現(xiàn)典型的鋪路石樣或不規(guī)則的內(nèi)皮細(xì)胞樣形態(tài)，具有貼壁生長(zhǎng)的特性。在良好的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞能夠迅速地生長(zhǎng)并形成致密的單層，有助于模擬體內(nèi)血腦屏障的緊密結(jié)構(gòu)。

細(xì)胞純度與活性

cEND 細(xì)胞系的純度較高，通常通過(guò)特定的分離和純化技術(shù)獲得，能夠保證細(xì)胞的均一性和穩(wěn)定性。細(xì)胞活性強(qiáng)，在適宜的培養(yǎng)環(huán)境中可以保持較高的增殖能力和代謝活性，為各種實(shí)驗(yàn)操作提供了良好的基礎(chǔ)。

表達(dá)的特異性標(biāo)記物

cEND 細(xì)胞能夠表達(dá)多種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，如 CD31、緊密連接蛋白（ZO - 1、occludin 等），這些標(biāo)記物的表達(dá)有助于確認(rèn)細(xì)胞的身份和功能狀態(tài)，同時(shí)也為研究血腦屏障的生理和病理機(jī)制提供了重要的指標(biāo)。

培養(yǎng)相關(guān)的技術(shù)參數(shù)

培養(yǎng)基的配方與優(yōu)化

cEND 細(xì)胞的培養(yǎng)基通常以 DMEM 為基礎(chǔ)，添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% L - 谷氨酰胺、2% MEM 套件、2% NEAA、10 ml 鈉丙酮酸以及 50 U/ml 青霉素 / 鏈霉素等成分。這種配方能夠滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和維持其特定功能的需求。在一些研究中，為了模擬不同的生理或病理?xiàng)l件，還會(huì)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，例如在低血清條件下培養(yǎng)以提高跨內(nèi)皮電阻（TEER），或者添加氫化可的松等物質(zhì)來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的屏障功能。

培養(yǎng)條件的控制

• 溫度 ：37℃是 cEND 細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度，該溫度能夠保證細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)。

• 氣體環(huán)境 ：細(xì)胞培養(yǎng)需要 5% 的 CO?和 95% 的空氣混合氣體環(huán)境，以維持培養(yǎng)基的 pH 值穩(wěn)定，確保細(xì)胞的正常生理功能。

傳代方法與頻率

當(dāng) cEND 細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)時(shí)，即可進(jìn)行傳代。通常使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液進(jìn)行消化，按照 1:2 至 1:4 的比例將細(xì)胞分散到新的培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)。在細(xì)胞狀態(tài)良好的情況下，可以每周進(jìn)行 1 至 2 次傳代，但需注意避免過(guò)度傳代導(dǎo)致細(xì)胞特性發(fā)生改變。

凍存與復(fù)蘇的方法與要點(diǎn)

• 凍存 ：將細(xì)胞收集并制成單細(xì)胞懸液，加入含 5% DMSO 的凍存液中，輕輕混勻后分裝于凍存管，放入 - 80℃冰箱中預(yù)凍，24 小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。凍存過(guò)程的關(guān)鍵在于控制好降溫速度和使用適宜的凍存保護(hù)劑，以減少細(xì)胞在凍存過(guò)程中的損傷。

• 復(fù)蘇 ：從液氮中取出凍存管，迅速放入 37℃水浴中快速解凍，待細(xì)胞懸液全解凍后，立即轉(zhuǎn)移到含有適量預(yù)熱培養(yǎng)基的離心管中，低速離心后去除上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。復(fù)蘇后的細(xì)胞需要仔細(xì)觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，并在后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中及時(shí)更換培養(yǎng)基，以幫助細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)活力。

細(xì)胞功能與應(yīng)用的技術(shù)指標(biāo)

血腦屏障功能的評(píng)估指標(biāo)

• 跨內(nèi)皮電阻（TEER） ：TEER 是衡量血腦屏障緊密性的關(guān)鍵指標(biāo)之一。cEND 細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下能夠形成具有較高 TEER 值的單層，TEER 值越高，說(shuō)明細(xì)胞間的緊密連接越緊密，血腦屏障的完整性越好。通過(guò)使用專業(yè)的電阻測(cè)量?jī)x，可以在不同的時(shí)間點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)條件下對(duì) TEER 進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，從而評(píng)估細(xì)胞屏障功能的變化。

• 滲透性實(shí)驗(yàn) ：利用熒光標(biāo)記的物質(zhì)（如 FITC - dextran 等）進(jìn)行滲透性實(shí)驗(yàn)，可以評(píng)估 cEND 細(xì)胞單層對(duì)不同分子量物質(zhì)的通透性。通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算出物質(zhì)的滲透系數(shù)，進(jìn)而了解血腦屏障對(duì)物質(zhì)的選擇性通透性特點(diǎn)，這對(duì)于研究藥物的腦內(nèi)傳遞以及血腦屏障在疾病中的功能改變具有重要意義。

細(xì)胞在研究中的應(yīng)用場(chǎng)景與技術(shù)要求

• 藥物篩選與毒性研究 ：cEND 細(xì)胞可以用于藥物透過(guò)血腦屏障的研究以及藥物毒性評(píng)價(jià)。在藥物篩選過(guò)程中，可以通過(guò)檢測(cè)藥物在細(xì)胞單層兩側(cè)的濃度變化、細(xì)胞的存活率、TEER 值的變化等指標(biāo)，來(lái)評(píng)估藥物的透過(guò)能力和對(duì)血腦屏障的潛在毒性。為了獲得準(zhǔn)確可靠的篩選結(jié)果，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，確保細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，并采用合適的檢測(cè)方法和數(shù)據(jù)分析手段。

• 細(xì)胞間相互作用研究 ：cEND 細(xì)胞還可以與神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等其他腦細(xì)胞類型進(jìn)行共培養(yǎng)，以研究血腦屏障細(xì)胞與其他腦細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系。在共培養(yǎng)體系中，可以通過(guò)觀察細(xì)胞的形態(tài)變化、分泌因子的表達(dá)水平、細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)通路激活情況等，深入了解細(xì)胞間通訊在維持血腦屏障功能以及參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。此外，還可以利用先進(jìn)的成像技術(shù)（如共聚焦顯微鏡等）對(duì)細(xì)胞間的相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察和分析，為研究提供更直觀的證據(jù)。

細(xì)胞鑒定的技術(shù)手段與標(biāo)準(zhǔn)

免疫熒光染色鑒定

免疫熒光染色是常用的 cEND 細(xì)胞鑒定方法之一。通過(guò)使用針對(duì)特異性標(biāo)記物（如 CD31、ZO - 1、occludin 等）的熒光標(biāo)記抗體，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物的表達(dá)和定位情況。正常的 cEND 細(xì)胞應(yīng)該呈現(xiàn)特異性標(biāo)記物的陽(yáng)性表達(dá)，并且這些標(biāo)記物在細(xì)胞間的緊密連接區(qū)域有明顯的定位信號(hào)，這有助于確認(rèn)細(xì)胞的身份和功能狀態(tài)是否符合要求。

流式細(xì)胞術(shù)分析

流式細(xì)胞術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地測(cè)定 cEND 細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)水平。將細(xì)胞收集并進(jìn)行適當(dāng)?shù)目贵w標(biāo)記后，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，可以獲得細(xì)胞表面特定標(biāo)記物的陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度等數(shù)據(jù)。根據(jù)已知的 cEND 細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)特征，可以對(duì)細(xì)胞的純度和特性進(jìn)行定量評(píng)估，從而判斷細(xì)胞是否符合實(shí)驗(yàn)研究的標(biāo)準(zhǔn)。

功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

除了上述的形態(tài)學(xué)和標(biāo)記物表達(dá)鑒定方法外，還可以通過(guò)對(duì) cEND 細(xì)胞進(jìn)行功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)其特性和適用性。例如，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞單層對(duì)已知大小和性質(zhì)的物質(zhì)的通透性、測(cè)量 TEER 值的變化以及觀察細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中的行為等，來(lái)驗(yàn)證細(xì)胞是否具有正常的血腦屏障功能以及是否能夠準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)環(huán)境下的細(xì)胞行為。功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以作為評(píng)估細(xì)胞質(zhì)量和技術(shù)參數(shù)是否符合要求的重要依據(jù)。