定量蛋白質組學的核心是利用質譜(MS)在不同實驗條件下準確測量蛋白質的豐度。質譜的高分辨率和高靈敏度可以精確量化蛋白質的表達水平,結合一些定量方法還可以同時分析多個樣本。zuì cháng yòng的策略包括非標記定量和標記定量。
一、非標記定量蛋白質組學
非標記定量是指不依賴任何化學或同位素標記的定量方法。蛋白質豐度是通過肽段的信號強度或譜計數來計算的。常用的非標記定量方法包括基于信號強度的定量和譜計數。
1、基于信號強度的定量
基于信號強度的定量通過測量質譜儀中檢測到的肽離子的強度來進行定量,假設肽離子的強度與其豐度成正比。在這種方法中,蛋白質經過酶解變為肽段,通過液相色譜分離,并用質譜進行分析。每個肽段的信號強度反映了其相對豐度,隨后用于估算樣本之間蛋白質表達的變化。這種方法簡單、成本效益高,適合大規模和復雜樣本的分析。然而,信號強度的準確性可能會受到離子化效率和樣本復雜度差異的影響。
2、譜計數
譜計數通過統計每個蛋白質匹配到的MS/MS譜圖的數量來估算蛋白質豐度。在質譜分析過程中,蛋白質被消化成肽段,這些肽段被碎裂并以譜圖的形式檢測。每個蛋白質的譜圖數量與其豐度成正比。譜計數方法簡單且具有高通量,常用于相對定量。然而,它存在一些限制:對離子化效率敏感,對低豐度蛋白質的準確性較差,且無法提供絕對定量。此外,其準確性高度依賴于參考數據庫的完整性。
圖1. 非標記定量蛋白質組學工作流程
3、4D非標記定量蛋白質組學
4D非標記定量蛋白質組學將離子遷移譜(IM)和數據獨立采集(DIA)技術結合,用于高分辨率、高通量的蛋白質定量。該方法整合了四維分離—保留時間、質荷比(m/z)、離子強度和離子遷移性—提高了選擇性和分辨率。通常在像Bruker timsTOF Pro這類儀器上使用diaPASEF(平行積累–串行碎裂)采集方法。工作流程包括蛋白質提取、酶解、液相色譜分離、離子遷移分離、質譜檢測以及下游生物信息學分析。該方法不需要任何標記,因此適用于多種生物樣本類型。
Jiang, H. et al. BMC Pregnancy and Childbirth, 2024.
圖2. 4D非標記定量蛋白質組學工作流程
4D非標記定量蛋白質組學顯著提高了低豐度蛋白質和結構相似肽段的識別,改進了定量的準確性,并增加了重復性。其非標記特性確保了更低的成本和更簡便的工作流程,適用于大規模研究。然而,這一方法需要特定的儀器和強大的數據分析能力,并且在批次間比較方面可能不如TMT或iTRAQ有效。它更適合深入的基礎研究和動態蛋白質組譜分析,而不是標準化的臨床應用。
二、標記定量蛋白質組學
在討論完非標記定量的優勢和挑戰后,我們接下來探討標記定量策略。標記定量依賴化學或同位素標簽來量化蛋白質豐度。這些策略通常提供更高的準確性,非常適合多個樣本之間的比較分析。
1、SILAC(細胞培養中氨基酸的穩定同位素標記)
SILAC是一種代謝標記技術,通過向培養細胞中添加穩定同位素標記的氨基酸,在合成過程中標記蛋白質。通過在細胞培養基中補充同位素標記的賴氨酸或精氨酸(如15N標記),蛋白質自然地將這些標簽納入其中。酶解后標記和未標記的肽段可以通過它們在質譜中的質量差異進行區分。SILAC能夠實現高度準確的定量,并且在分析復雜生物基質中的低豐度蛋白質時特別有用。
Chen, X. et al. Proteomics, 2015.
圖3. SILAC定量蛋白質組學工作流程
SILAC具有高靈敏度和精度,廣泛適用于各種生物學模型。然而,它也有一些限制,比如試劑成本較高,且需要高性能的質譜平臺和數據處理能力。
2、iTRAQ(同位素標記相對和絕對定量)
iTRAQ是一種化學標記技術,使用同位素標簽進行多個樣本中蛋白質的相對和絕對定量。每個iTRAQ標簽包含一個報告基團和一個反應基團。在質譜/質譜分析過程中,標簽碎裂并釋放出dú tè的報告離子,這些報告離子的強度反映了來自不同樣本的肽段的豐度。iTRAQ允許在一次運行中同時分析多達8個樣本,從而顯著提高通量。
圖4. iTRAQ標簽結構
iTRAQ因其一致的MS1質量值和dú tè的MS2報告離子進行定量,提供了高準確性和重復性。它廣泛用于疾病研究、藥物開發和生物標志物發現。然而,iTRAQ的成本較高,并且在復雜樣本中可能會受到報告離子干擾,影響定量精度。正確的標記和樣本準備對可靠結果至關重要。
3、TMT(串聯質譜標簽)
TMT是另一種同位素標記技術,用于相對定量。它通過相同質量的標簽標記來自不同樣本的肽段。在MS/MS碎裂過程中,這些標簽釋放出dú tè的報告離子,使得可以基于離子強度進行定量。與iTRAQ類似,TMT提供準確且可重復的相對定量,適用于多個樣本的比較分析。
圖5. 10-plex TMT蛋白相對定量工作流程
TMT使得最多可以同時分析16至18個樣本(TMTpro),非常適合大規模的比較研究。它提供高精度和改進的數據一致性。然而,TMT試劑的成本和樣本處理的復雜性是潛在的限制因素。報告離子之間的干擾可能發生,尤其是在高度復雜的樣本中,這可能會影響定量準確性。
總結
定量蛋白質組學已成為現代生命科學中bù kě huò quē的工具,支持基礎研究、臨床診斷和藥物開發的突破。無論是標記定量還是非標記定量策略,都有其dú tè的優勢和挑戰,選擇合適的方法對于研究的準確性和效率至關重要。隨著技術的不斷發展,定量蛋白質組學將在精準醫療和生物標志物發現中發揮越來越重要的作用。
作為專注于蛋白質組學領域的科研服務平臺,百泰派克生物科技將持續關注定量蛋白質組學技術的發展動態,結合先進平臺和專業團隊,為科研人員提供更高質量的內容解讀與實用服務,共同推動蛋白質組學在生命科學中的創新與應用。
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