重組人IL2原核表達載體構建與轉化

來源：賽爾瑞成（北京）生命科學技術有限公司 2025年08月12日 11:42

　　重組人IL2通過原核表達系統生產是一種高效且廣泛應用的技術路線，但其過程需要克服多種技術挑戰以確保產品的活性、純度和安全性。以下是從基因克隆到最終制劑的關鍵步驟詳解：

　　一、重組人IL2原核表達載體構建與轉化

　　1.分子設計要點

　　密碼子優化

　　由于大腸桿菌偏好特定密碼子用法，需對人IL-2成熟肽編碼序列進行同義突變改造，避免稀有密碼子導致的翻譯停滯。例如將人類基因中的AGA/AGG替換為E.coli高頻使用的GCG等。

　　融合標簽選擇

　　常用His-tag（6×組氨酸）、GST或MBP標簽便于親和層析純化，但需注意標簽位置不影響N端信號肽切割及生物活性。部分研究采用SUMO融合提高可溶性表達。

　　啟動子強度調控

　　使用T7強啟動子配合Lac阻遏系統實現誘導控制，防止基礎表達過高導致包涵體過早形成。建議設置梯度IPTG濃度實驗確定最佳誘導時機。

　　2.轉化效率提升策略

　　采用電穿孔法轉化感受態細胞，轉化率可達107CFU/μgDNA以上。通過抗生素平板篩選單克隆后，進行菌落PCR驗證插入片段完整性。

　　二、重組人IL2包涵體變性復性工程：

　　1.洗滌純化流程

　　選擇性提取

　　使用含2M尿素的緩沖液反復洗滌沉淀，去除膜碎片、核酸等雜質，此時大部分雜蛋白已被溶解剔除。

　　變性處理

　　在8M尿素+10mMDTT中完*解聚蛋白質二硫鍵，離心去除不溶物質后獲得澄清裂解物。

　　梯度透析復性

　　采用階梯式尿素濃度遞減方案（8M→6M→4M→2M→0M），每步間隔4小時，配合緩慢攪拌促進正確折疊。添加0.5ML-精氨酸作為分子伴侶增強復性效率。

　　2.色譜精細純化

　　離子交換層析（IEX）：利用HETP特性分離電荷異質性組分，陽離子交換柱收集目標峰；

　　疏水相互作用色譜（HIC）：去除殘留的疏水性聚集體；

　　尺寸排阻色譜（SEC）：最后拋光步驟確保單體純度＞98%，去除多聚體及碎片。

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