磺胺嘧啶檢測試劑盒（養殖水樣）使用說明書

【原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物磺胺嘧啶與微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗磺胺的抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含磺胺嘧啶的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出殘留物磺胺嘧啶的含量。

【試劑盒技術指標】   

規      格：96孔/盒

靈 敏 度：0.2ppb

檢測時間： 45min

樣本定量檢測下限：  

水產養殖尾水………………………………………3ppb

樣本回收率

水產養殖尾水…………………………………80±15%

反應率 ：

磺胺嘧啶 …………………………………… 100%

【試劑盒組成】   

1． 微量測試孔：每條8孔，一板12條

2． 標 準 液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.2ppb、0.6pb、 1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb

3． 高濃度標準品：×1瓶：（1ml/瓶） 100ppb

4． 酶標記物     7ml ………………………  紅色帽

5． 抗體工作液 7ml ………………………  綠色帽

6． 底物A液    7ml ………………………  棕色帽

7． 底物B液　7 ml ………………………  黑色帽

8． 終止液        7 ml …..…………………… 黃色帽

9． 20X濃縮洗滌液40 ml …………………白色帽

10． 2X濃縮復溶液 50 ml …………………  藍色帽

【所用儀器、試劑】   

具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl，多道250µl

試         劑：去離子水（或蒸餾水）

【實驗前溶液配制】

配液1、1×樣本復溶液：用去離子水將2X濃縮復溶液按1：1稀釋

（1份濃縮復溶液+1份去離子水）用于樣本復溶。

配液2：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19

               稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量

               配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】   

樣本前處理須知    處理任何樣本時，都必須注意：

（1）本試劑盒所檢測的水樣樣本包括：養殖用水和水產尾水。

（2）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同試劑時要更換吸頭。

（3）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

樣本前處理步驟

（a）水產養殖尾水

1、取50µl待檢水產養殖尾水與200µl配制好的1×樣本復溶液按稀釋，混合30s；

2、取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數：5倍      

【酶標免疫分析程序】   

操作步驟：

1、 將所需試劑從冷藏環境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標準品/樣本50µl /孔，然后加酶標記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環境反應30min。

5、 取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）

6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環境避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測在5min內讀完數據），測定吸光度值（OD值）。

【結果判定】   

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與磺胺嘧啶的含量成負相關。

1、 粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng /ml)。假設樣本1的吸光度值為0.221，樣本2的吸光度值為0.795，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.81；0.2ppb為1.50；0.6ppb為1.114；1.8ppb為0.660； 5.4ppb為0.318；16.2ppb為0.145。則樣本1的濃度范圍是5.4ppb-16.2ppb；樣本2的濃度范圍是0.6ppb-1.8ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中磺胺嘧啶實際含量。

2、 定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以磺胺嘧啶濃度（ng /ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中磺胺嘧啶實際含量。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

3、標準曲線：

B/B0 (%)

         0.2                0.6                1.8                   5.4               16.2

 (ppb) [µg/kg]

圖1：磺胺嘧啶檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現性：

%CV 

      0      0.2            0.6             1.8          5.4         16.2

(ppb) [µg/kg]

圖2：磺胺嘧啶檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出磺胺嘧啶檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應磺胺嘧啶濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。

【注意事項】   

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

【儲存】

原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。