一、背景

大鼠肝竇內皮細胞分離自肝臟組織；采用混合酶灌流消化、反復低速離心、密度梯度離心法，并通過內皮細胞專用培養基培養篩選制備而來；細胞經Dil-Ac-LDL免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

肝竇內皮細胞（SEC）是肝臟內所占比例的非實質細胞，位于肝竇腔與肝細胞之間，具有物質轉運、吞噬、抗原提呈、免疫耐受等功能。

SEC由于擁有一般細胞所沒有的窗孔結構、細胞間連結松散、內皮下缺少基底膜而使其具有高度通透性，從而達到快速交換各種大小分子的目的。肝在遭到多種病原侵襲時，肝竇內皮細胞窗孔逐漸減少或消失，內皮下基膜形成，產生類似于連續型毛細血管的結構，這一過程稱為肝竇毛細血管化。它由多種因素引起，其過程極復雜，在多種肝病的發病前期階段均有出現，近年來受到廣泛關注。

二、大鼠肝竇內皮細胞的復蘇與鋪板

1、將15ml離心管插入盛有足量碎冰的冰盒中，紫外消毒15min；4℃預冷離心機。

2、復蘇培養基放碎冰中充分預冷，鋪板培養基放入38℃恒溫水浴鍋中充分預熱。

3、將凍存的細胞從冷藏位置迅速轉移至38℃恒溫水浴鍋中。盡可能多的浸入38℃水中，順時針水平搖動，但必須確保凍存管管蓋保持在水面以上。

4、解凍凍存管約90-120s，至凍存管中只有少量碎冰漂浮即可。

5、用75%酒精消毒凍存管，并將其轉移到生物安全柜。

6、用寬口槍頭將大鼠肝竇內皮細胞重懸（輕輕吹打2次），并轉移至預冷的15ml離心管中（注意：凍存管與槍頭上殘留細胞，可用1ml復蘇培養基清洗凍存管與槍頭）。

7、向細胞懸液逐滴加入預冷復蘇培養基，每1ml細胞懸液加入10ml復蘇培養基（注意：前3ml要緩慢逐滴加入并輕微搖晃，后面7ml可加快速度），最后輕微上下顛倒1次混勻。

8、300×g，4℃離心5min，去上清并用培養基重懸。

9、沉淀的細胞用肝竇內皮細胞培養基重懸并定容至4ml，用臺盼藍排除法測定細胞的存活率和細胞總量。

10、將細胞按3×104cells/cm2接種至膠原包被培養板中。搖勻，在37℃/5%CO2培養箱中培養，24h后換液。

三、大鼠肝竇內皮細胞培養與傳代

1、大鼠肝竇內皮細胞融合度達到80%時可進行傳代。

2、提前將培養基、PBS、胰酶放入37℃水浴鍋內預熱，用75%酒精擦拭后再放入超凈臺內。

3、吸除舊培養液，加少量PBS潤洗細胞，適量胰酶，使加入的胰酶能蓋住細胞，37℃孵育，約2~3min。

4、顯微鏡下觀察，待貼壁細胞間間隙變大、細胞趨于圓形但還未漂起時棄去胰酶，加入新鮮肝竇內皮細胞培養基，晃動細胞瓶，終止胰酶作用，用吸管小心吹打貼壁的細胞，制成細胞懸液（控制吹打的力度，避免產生大量的氣泡）。

5、300×g，室溫離心5min，去上清并用培養基重懸。

6、將細胞懸液按3×104cells/cm2接種到新的膠原包被培養瓶/板內，置37℃/5%CO2培養箱培養，隔天觀察貼壁生長情況。

四、應用

大鼠肝竇內皮細胞可以用于天麻素調控p38 MAPK/Nrf2/HO-1通路減輕小鼠肝竇內皮細胞氧化損傷的機制研究：

探討GSTD在LSECs氧化損傷中的保護作用及其分子機制,為臨床HIRI的防治提供理論依據。

方法：首先使用1mM H2O2構建LSECs的氧化應激模型,同時給予1、10及50μM GSTD處理細胞,通過檢測ROS、MDA的含量,評價了GSTD在LSECs氧化應激過程中的緩解作用;通過TUNEL法、Annexin V-FITC-PI雙染法檢測細胞凋亡,觀察GSTD處理對H202誘導的LSECs凋亡的影響,并通過western blot檢測凋亡相關蛋白表達;其次,我們使用10mM的SB 203580和1mM的Znpp分別處理細胞,通過western blot檢測了p38MAPK/Nrf2/HO-1這一氧化應激相關通路的蛋白變化,并進行了氧化應激及細胞凋亡相關指標的檢測;

進一步構建了Nrf2過表達及Nrf2和HO-1的siRNA敲減細胞模型,通過核質分離和免疫共沉淀檢測Nrf2在細胞質和細胞核中的變化,驗證GSTD通過p38MAPK調控Nrf2/HO-1在抗氧化損傷過程中的作用;

此外,GSTD腹腔灌注后建立小鼠HIRI模型,通過檢測血清中AST、ALT水平及肝臟組織HE染色,觀察GSTD對肝臟損傷的保護作用;通過TUNEL法檢測細胞凋亡情況;檢測小鼠組織中MDA和SOD的含量;RT-PCR和Western blot分別檢測了小鼠肝臟組織中HO-1、Nrf2、IL-6和TNF-α的mRNA及蛋白的表達情況,進一步研究了GSTD對小鼠HIRI的保護作用。

結果：首先在體外實驗中發現,在H202誘導LSECs的氧化應激模型中,經GSTD預處理的LSECs中ROS和MDA的含量降低,提示GSTD能抑制H202誘導的氧化應激;TUNEL法、Annexin V-FITC-PI雙染法檢測發現GSTD處理后的細胞凋亡水平降低,提示GSTD對于H202誘導的細胞凋亡具有抑制作用;其次,研究提示GSTD抑制H202誘導的細胞凋亡和氧化應激反應是通過促進p38 MAPK的磷酸化從而激活Nrf2/HO-1通路實現的。GSTD處理后,p38 MAPK的磷酸化水平顯著上升,并且高濃度的GSTD能夠抵消p38MAPK抑制劑的作用。

同時GSTD能使Nrf2、HO-1的表達水平顯著上調。利用shRNA敲低Nrf2的表達后,HO-1的表達隨之降低,同時TUNEL陽性細胞的比例上升,ROS和MDA含量顯著上升。核質分離及免疫共沉淀結果顯示,GSTD在氧化應激刺激下調控Nrf2的主要途徑是誘導Nrf2的核轉位。小鼠體內實驗結果顯示,HIRI造成了肝臟氧化應激和炎癥反應、肝臟細胞凋亡、壞死,而GSTD的預處理能夠降低血清AST、ALT水平,減輕肝細胞壞死、凋亡、降低MDA水平,增加SOD活性,上調Nrf2和HO-1的表達,下調IL-6和TNF-α的表達,提示GSTD預處理在小鼠HIRI中發揮抗炎、抗氧化、抗凋亡作用。

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