在細胞培養領域，永生化人骨髓間充質細胞 – hTERT 始終是前沿研究的熱點。它憑借工作原理，為細胞生物學研究、藥物開發和再生醫學探索開辟了全新路徑。本文將深入剖析其工作原理，助力科研人員更好地利用這一強大工具。

一、hTERT 的關鍵作用

hTERT 即人端粒酶逆轉錄酶，是端粒酶復合體的核心功能亞基。在正常體細胞中，端粒酶活性較低，隨著細胞分裂次數增多，端粒逐漸縮短，最終細胞進入衰老狀態。而通過將 hTERT 基因導入人骨髓間充質細胞，可重新激活端粒酶活性，使細胞具備永生化特性。

端粒酶激活后，能夠以自身的 RNA 成分為模板，合成端粒重復序列并添加到染色體末端，維持染色體完整性。這相當于為細胞的分裂能力裝上了“永動機”，突破了細胞的自然增殖極限，為大規模細胞培養和長期實驗研究提供了穩定細胞來源。

二、細胞生理特性轉變

（一）細胞周期調控改變

在 hTERT 永生化過程中，細胞周期調控機制發生顯著變化。細胞周期由 G1、S、G2 和 M 期組成，其中 G1 期是細胞生長和準備 DNA 合成的關鍵階段。hTERT 的引入使細胞在 G1 期的停滯時間縮短，加速進入 S 期進行 DNA 合成，從而提高細胞增殖速率。

具體而言，hTERT 激活后，細胞內 cyclin D1 等細胞周期蛋白表達上調。這些細胞周期蛋白與 cyclin 依賴性激酶（CDK）結合，形成活性復合物，磷酸化 Rb 蛋白等下游底物，解除對細胞周期的抑制，促使細胞快速通過限制點，進入 S 期，實現細胞周期的加速運轉。

（二）細胞代謝重塑

細胞代謝是維持細胞生命活動的核心過程，永生化后細胞的代謝模式發生重塑以適應持續增殖的需求。細胞的糖代謝途徑發生改變，糖酵解過程增強，即使在氧氣充足的情況下，細胞也傾向于通過糖酵解產生 ATP，而非全依賴線粒體的氧化磷酸化。這種代謝模式被稱為“瓦博格效應”。

此外，細胞的氨基酸代謝和脂肪酸合成也顯著增強。氨基酸代謝為細胞提供合成生物大分子所需的氮源和碳源，脂肪酸合成則為細胞膜的生物合成提供原料，滿足細胞快速增殖過程中細胞膜擴增的需求。代謝產物如 α - 酮戊二酸等還參與細胞內的信號轉導，調節細胞增殖、分化和凋亡等生理過程，形成復雜的代謝與信號調控網絡，共同支持細胞的永生化狀態維持。

（三）細胞基因表達重編程

基因表達調控是細胞生理功能實現的基礎，hTERT 永生化引發細胞基因表達重編程。一系列與細胞增殖、抗凋亡和代謝相關的基因表達上調，而與細胞衰老和分化相關的基因表達下調。

例如，細胞增殖相關基因如 MYC、cyclin E 等表達增加，MYC 蛋白能夠結合到基因啟動子區域，激活一系列促進細胞周期進展和蛋白質合成的基因表達，推動細胞增殖；抗凋亡基因如 BCL - 2、BCL - XL 等表達升高，這些基因編碼的蛋白能夠抑制細胞凋亡信號通路中線粒體釋放細胞色素 C 等關鍵步驟，阻止細胞凋亡的發生，使細胞能夠在較長時間內保持活力。同時，細胞衰老相關基因如 p16、p21 等表達受到抑制，減少對細胞周期的負向調控，進一步保障細胞的持續增殖能力。基因表達重編程為細胞在永生化后的長期存活和功能維持提供分子基礎。

三、細胞功能特性維持與拓展

（一）干細胞特性的保留與強化

盡管細胞實現了永生化，但其干細胞特性不僅得以保留，還得到一定程度的強化。細胞仍具有自我更新能力，在適宜的培養條件下能夠持續產生與親代細胞具有相同特征的子代細胞，保持細胞群體的均一性和穩定性。同時，細胞的多向分化潛能也得以維持，能夠在特定誘導因素的作用下分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等多種細胞類型。

例如，在含有地塞米松、β - 甘油磷酸鈉和抗壞血酸等成骨誘導因子的培養基中培養，細胞能夠啟動成骨相關基因如 RUNX2、OSTEOPONTIN 等的表達，合成并分泌骨基質蛋白，形成鈣化結節，完成向成骨細胞的分化轉變，展現出在骨組織工程領域的應用潛力。這種干細胞特性的保留與強化，使細胞在再生醫學研究中具有重要價值，為組織修復和再生提供細胞來源。

（二）細胞間通訊能力的增強

細胞間通訊對于細胞群體的協調生長和功能發揮至關重要，永生化后細胞的細胞間通訊能力得到增強。細胞通過旁分泌和自分泌等多種方式分泌多種細胞因子和生長因子，如 VEGF（血管內皮生長因子）、PDGF（血小板衍生生長因子）、IL - 6（白細胞介素 - 6）等。

這些因子在細胞間傳遞信號，調節細胞的增殖、遷移和分化等生理活動。以 VEGF 為例，它能夠與鄰近細胞表面的 VEGF 受體結合，激活下游信號通路，促進血管生成，改善細胞微環境中的血液供應，為細胞的生長和組織修復提供營養支持。同時，細胞分泌的生長因子還能反饋調節自身和其他細胞的增殖狀態，形成復雜的細胞間通訊網絡，增強細胞群體的整體功能和適應性。

四、細胞培養條件優化

（一）培養基成分精準調控

培養基是細胞生長的“土壤”，其成分的精準調控對永生化人骨髓間充質細胞 – hTERT 的培養至關重要。基礎培養基通常選用含有豐富營養成分的 α - MEM 或 DMEM 培養基，這些培養基含有氨基酸、維生素、葡萄糖等基本營養物質，滿足細胞的代謝需求。

在此基礎上，添加適量的胎牛血清是必要的，血清中含有多種生長因子、細胞黏附因子和營養成分，如胰島素、轉鐵蛋白等，能夠促進細胞的貼壁和增殖。但血清成分復雜，為避免血清中潛在的未知成分對實驗結果產生干擾，還可以采用無血清培養基，并添加特定的生長因子組合，如 FGF - 2（成纖維細胞生長因子 - 2）、EGF（表皮生長因子）等，精確調控細胞的生長和分化狀態。同時，為維持細胞的的最佳生長環境，還需要精確控制培養基中的無機鹽濃度和 pH 值，一般將 pH 值維持在 7.2 - 7.4 之間，通過添加碳酸氫鈉等緩沖劑來實現穩定 pH 值的目的。

（二）培養環境精細設置

適宜的物理環境是細胞良好生長的保障。溫度是關鍵因素之一，一般將細胞培養環境溫度設置為 37℃，這是因為人體正常生理溫度接近 37℃，細胞在這一溫度下能夠保持最佳的酶活性和代謝速率，有利于細胞的正常生長和增殖。濕度也需維持在較高水平，通常保持培養箱內濕度在 95% 以上，防止培養基中水分過度蒸發，導致培養基成分濃度改變，影響細胞生長環境的穩定性。

氣體環境方面，細胞需要 5% 二氧化碳和 95% 空氣的混合氣體環境。二氧化碳在培養環境中起到調節 pH 值的作用，它能夠與培養基中的碳酸氫鈉反應生成碳酸，從而維持培養基 pH 值的穩定。為確保細胞在培養過程中始終處于適宜的氣體環境中，培養箱需配備精確的氣體控制系統，實時監測和調節氣體成分比例。

（三）細胞傳代策略制定

合理的細胞傳代策略能夠確保細胞的長期穩定培養和功能維持。當細胞生長至一定密度，一般達到 80% - 90% 匯合度時，即可進行傳代操作。傳代過程需采用溫和的胰酶消化方法，消化時間控制在 1 - 2 分鐘，避免過度消化導致細胞膜受損或細胞內酶活性喪失，影響細胞的再貼壁和后續生長。

細胞傳代比例根據細胞生長特性和實驗需求確定，通常采用 1 : 3 或 1 : 4 的傳代比例。較低的傳代比例有助于細胞較快地適應新環境并進入生長期，但可能導致培養容器空間較快耗盡；較高的傳代比例則可延長細胞的培養周期，但初期細胞密度較低，可能需要較長時間才能達到理想生長狀態。因此，在實際操作中，需要根據細胞的具體生長情況和實驗安排靈活調整傳代比例，以實現細胞培養的高效性和穩定性。