在細胞培養領域，永生化人骨髓間充質干細胞備受關注，因其在再生醫學、藥物篩選和疾病研究等方面展現出巨大潛力。為助力科研工作者高效開展相關研究，本文聚焦于永生化人骨髓間充質干細胞的操作使用，提供全面且實用的培養全流程管理建議。

一、細胞凍存的黃金法則

細胞凍存是細胞培養過程中的關鍵環節，目的是在極低溫度下保持細胞的活性和特性，以備后續使用。

（一）凍存液的精準配置

凍存液由基礎培養基、胎牛血清和冷凍保護劑組成，一般按照體積比 5 : 3 : 2 進行配置。基礎培養基為細胞提供基本的營養成分，維持細胞的代謝活性；胎牛血清富含多種營養物質和細胞生長因子，有助于維持細胞的穩定狀態；冷凍保護劑通常選用甘油或二甲基亞砜（DMSO），它們能夠降低細胞內水分的冰點，減少細胞內冰晶的形成，從而降低細胞在凍存過程中受到的損傷。

（二）凍存操作的精細流程

將細胞凍存至 - 80℃是關鍵步驟之一。首先需將細胞從培養皿中輕輕消化并制成細胞懸液，用凍存液按合適的比例進行稀釋，將細胞濃度調整至 1×10^6 - 5×10^6 個 / mL。將混合后的細胞懸液分裝至凍存管中，每管裝液量約為 1 - 1.5 mL。隨后，將凍存管置于 - 80℃的冰箱中，一般需要經過 24 - 48 小時的冷凍過程，使細胞充分適應低溫環境，降低代謝速度，同時減少細胞內水分的冰晶形成，從而降低細胞受到的凍存損傷。

二、細胞復蘇的細膩操作

細胞復蘇是將凍存的細胞快速恢復到常溫并重新進入生長狀態的過程，操作的精細程度直接關系到細胞的復蘇成功率和活性。

（一）溫度的精準調整

從 - 80℃取出凍存管后，需立即將其放入 37℃的水浴中快速解凍。水浴的溫度要嚴格控制，過高會導致細胞受熱不均，引起細胞膜結構的破壞；過低則會使解凍速度過慢，細胞內部形成冰晶，損傷細胞內的細胞器。快速解凍能確保細胞內外溫度均衡上升，減少細胞內冰晶的生成和細胞的損傷，使細胞在短時間內恢復到正常狀態。

（二）適應性培養的細致安排

解凍后的細胞經過離心去除凍存液后，要用新鮮培養基進行重懸，然后置于細胞培養箱中進行培養。培養箱的溫度、濕度和氣體環境要精確調節，一般溫度為 37℃，濕度保持在 95% 以上，氣體環境為 5% 二氧化碳和 95% 空氣。細胞在復蘇后的最初 24 - 48 小時內，生長狀態較為脆弱，需要密切觀察細胞的形態和生長情況，必要時更換培養基，以確保細胞順利適應培養環境，恢復正常的生長代謝。

三、細胞污染的防治要訣

細胞污染是細胞培養中的常見問題，它會嚴重影響細胞的生長和實驗結果的準確性，因此預防和處理細胞污染至關重要。

（一）培養環境的嚴格維護

細胞培養環境包括培養箱、超凈工作臺和培養基等。培養箱要定期進行清潔和消毒，去除內部的灰塵和細菌，一般每兩周使用 75% 的酒精擦拭培養箱內壁，并開啟培養箱的高溫滅菌功能進行滅菌。超凈工作臺在使用前要提前開啟，讓其運行一段時間，以凈化空氣，確保在細胞操作過程中有一個無菌的環境。培養基則要嚴格控制保存條件，一般在 4℃保存，且在有效期內使用，避免培養基被污染或變質，從而降低細胞污染的風險。

（二）操作人員的衛生管理

操作人員是細胞培養過程中的潛在污染源之一，因此要重視個人衛生和操作規范。在進行細胞操作前，要洗凈雙手，并戴上無菌手套，避免手上的細菌和微生物接觸到細胞或培養基。同時，要穿著干凈的實驗服，佩戴口罩和帽子，防止頭發和口鼻中的微生物污染細胞。操作過程中，動作要輕柔、迅速，減少細胞暴露在外界環境中的時間，降低細胞受到污染的可能性。

（三）抗生素使用的策略

合理使用抗生素是防止細胞污染的有效輔助手段。在細胞培養初期，可以在培養基中加入適量的青霉素 - 鏈霉素溶液，一般濃度為 100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素。這兩種抗生素能夠有效抑制革蘭氏陽性和陰性細菌的生長，但長期使用可能使細胞產生耐藥性，或對細胞的生長產生一定的抑制作用。因此，在細胞生長狀態穩定后，應逐漸降低或停止使用抗生素，以確保細胞在正常生理環境下的生長。