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三維細胞培養系統是一種通過構建三維空間結構，模擬細胞在體內自然微環境的體外培養技術，旨在彌補傳統二維細胞培養與動物實驗間的差距，為細胞提供更接近生理狀態的生長條件。該系統核心在于通過支架材料或無支架技術構建三維結構。支架材料包括天然的膠原、Matrigel及合成材料如聚乳酸、聚苯乙烯等，它們通過調整孔隙率、力學性能支持細胞黏附、遷移及功能表達。無支架技術則包括懸滴法、磁力懸浮等，利用重力或磁場使細胞聚集成球。
三維細胞培養系統有多種類型，常見的包括基于基質膠、細胞外基質支架、微流控芯片以及旋轉培養系統等，不同系統操作方法有所差異。以下是一些常見三維細胞培養系統的操作指南：
1、基于基質膠的三維細胞培養
實驗材料準備：準備基質膠、適合細胞生長的培養基、細胞、24孔板或6孔板等實驗耗材。
基質膠預處理：將基質膠從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱過夜融化。然后根據實驗需求，按一定比例與培養基混合稀釋，如1:10。將稀釋后的基質膠均勻鋪在培養板孔中，每孔約200-300μL，輕輕晃動培養板使其覆蓋孔底，再將培養板放入37℃、5%CO?培養箱中孵育30-60分鐘，使基質膠形成凝膠狀基底。
細胞接種與培養：將處于對數生長期的細胞消化下來，用含血清培養基重懸制成單細胞懸液。使用細胞計數板計數，根據實驗設計調整細胞密度，一般建議在5×10?-1×10?個/mL。將細胞懸液均勻接種到鋪好基質膠的培養孔中，每孔約200-300μL，輕輕晃動培養板使細胞均勻分布，然后放入培養箱培養，定期更換培養基。
實驗觀察與分析：通過倒置顯微鏡觀察細胞形態變化，記錄生長、增殖情況。還可根據實驗目的，采用MTT實驗、劃痕實驗等方法對細胞功能進行檢測，最后對實驗數據進行統計分析。
2、基于細胞外基質（ECM）和Transwell系統的三維細胞培養
材料準備：準備Matrigel或其他ECM、預冷無菌1.5ml離心管、Transwell插入（24孔或12孔，根據細胞大小選擇孔徑）、適配多孔板、細胞系或類器官模型、培養基、無菌移液器與槍頭、無菌PBS緩沖液等。
ECM預處理：將ECM懸浮液從冰箱取出保持在冰上，用預冷移液器移取適量分裝到離心管中。然后將少量ECM加入到Transwell系統的下腔室底部，涂布均勻，放入37℃溫箱孵育30分鐘使其固化。
細胞或類器官懸液制備：胰酶消化細胞后重懸于培養基中，計數并調整濃度至1-5×10?cells/ml。若為類器官，先用ECM包被，再輕輕重懸至ECM中并調整濃度。
Transwell插入預處理：在每個Transwell插入的內腔中加入50-100μl的ECM，確保覆蓋孔膜表面，孵育30分鐘至固化。
細胞或類器官接種：將細胞懸液或類器官懸液滴加到Transwell插入的內腔中，然后向上腔室和下腔室加入合適的培養基，注意避免氣泡產生。
培養與維護：將多孔板放入37℃、5%CO?培養箱中培養，每隔2-3天更換上腔室和下腔室的培養基，更換時小心吸除舊培養基，避免擾動細胞或類器官。
分析與記錄：定期用顯微鏡觀察生長情況，記錄圖像和形態學變化。還可根據需求收集細胞或類器官，用于免疫熒光、qPCR等功能分析，同時記錄培養情況和相關數據。
3、微重力3D旋轉細胞培養系統
系統安裝：將回旋主機放置在培養箱內，確保旋轉座與培養箱內壁至少保留10cm間隙。使用配套扁平電纜連接控制器與主機，注意接口防塵。接入220V交流電。
參數設置：通過控制器觸屏選擇重力模式，如微重力（1-4rpm）或超重力（2-5g），還可設置定時啟動、旋轉速度梯度變化等程序。
培養容器準備：若為懸浮細胞培養，可使用T25培養瓶或轉壁式EP管反應器，注意培養基充注量。進行3D球體培養時，優化細胞密度，如5×10³-1×10?cells/mL，添加低血清培養基。
系統啟動與監測：啟動系統后，通過重力傳感器查看X/Y/Z軸重力數值，確保實驗條件穩定。系統支持37°C、5%CO?培養箱環境，需提前校準溫濕度參數。
注意事項：控制器需遠離強磁場環境，啟動前確認旋轉框無阻擋。定期用75%酒精擦拭旋轉座表面，防止污染，且定期對重力傳感器校準。
4、基于水凝膠的三維細胞培養（以CulXⅡ型為例）
材料準備：準備CulXⅡ型水凝膠凍干粉、細胞培養基、待培養細胞。
水凝膠制備：根據需要加入一定量的細胞培養基溶解凍干粉，如加入5ml培養基，使用平頭移液槍頭輕輕吹打至凍干粉充分分散，然后轉移至無菌離心管中，渦旋30-60秒至完q溶解。隨后4000轉離心5分鐘除去氣泡。
細胞接種：將混合溶液加入沉淀的待培養細胞中重懸細胞，并調整到所需細胞濃度，對于類器官培養，推薦細胞密度為5×10?到1×10?左右。將得到的混合懸液接種到無TC處理的細胞培養板。
培養與換液：將培養板放入37°C二氧化碳培養箱中培養。換液時可采用回收重懸換液或半量換液兩種方式。回收重懸換液即吸取培養體系，加入緩沖液或培養基稀釋10倍，混勻后1500轉離心5分鐘，沉淀回收細胞，再用同樣支架濃度的培養基懸浮細胞后加入培養容器。半量換液則是取出一半體積的培養體系，加入另一培養孔，再用同樣支架濃度的培養液補滿并吹打混勻。
細胞回收：吸取培養體系置于無菌離心管內，加入緩沖液或培養基稀釋10倍，混勻后1500轉離心5分鐘，即可沉淀回收細胞。
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