你的磷酸化抗體，可能正在毀掉實驗？

蛋白磷酸化作為信號通路研究的 "黃金指標"，其檢測堪稱科研人必修的 "顯微鏡級" 技術活。Western blot 雖為常規手段，但磷酸化檢測的特殊性，讓每個環節都藏著 "翻車風險"。今天就來拆解這套 "高難度動作" 的正確打開方式 ——

一、解碼樣品：先摸清磷酸化蛋白的 "脾氣"

磷酸化蛋白往往是細胞里的 "特殊玩家"，想讓它們 "現身" 得用點巧勁：

刺激誘導有講究：物理 / 化學刺激是激活磷酸化的常用手段，但時間和強度堪稱 "玄學"—— 查文獻 + 預實驗是捷徑（比如某細胞因子可能需 37℃刺激 15 分鐘才觸發磷酸化）。

數據庫助攻：PhosphoSitePlus 堪稱 "磷酸化百科全書"，輸入蛋白名稱即可解鎖其磷酸化位點、修飾頻率等 "隱藏信息"。

對照雙保險：陽性對照（已知磷酸化樣本）和陰性對照（未刺激樣本）必須配齊，否則抗體認沒認錯 "目標" 都難說！

二、蛋白提取：與時間賽跑的 "冰上芭蕾"

核心法則：快準冷 + 抑制劑護體

制樣速度決定成敗：

細胞洗滌用 4℃預冷 PBS，組織研磨請搬出液氮 "速凍"，全程讓樣品待在 "冰爽世界"，防止磷酸化 "轉瞬即逝"。

抑制劑是 "守護神"：

裂解液必須現配現用，蛋白酶抑制劑 + 磷酸酶抑制劑是 "基礎套餐"；若檢測酪氨酸磷酸化，1μmol/L 原釩酸鈉是 "隱藏菜單"。

劃重點：部分磷酸化抗體明確禁止煮沸變性（會破壞磷酸化位點），上樣前務必細讀抗體說明書！

保存細節控：提取后的蛋白盡快分裝成小份，-80℃凍存，反復凍融 = 讓磷酸基團 "離家出走"。

三、內參雙殺：破解磷酸化數據的 "密碼本"

為什么別人的結果能發高分刊？可能贏在了內參設計：

總蛋白內參：比如檢測 p-Akt，必須同時跑 Akt 總蛋白 —— 磷酸化 / 總蛋白的比值變化，才是真正的 "磷酸化水平證據"。

體系內參：Actin 或 GAPDH 是 "重量監督員"，確保每孔上樣量一致，不然條帶深淺可能只是 "上樣誤差的障眼法"。

四、WB 操作：磷酸化條帶 "顯影秘籍"

1. 上樣與抗體的 "劑量博弈"

磷酸化蛋白含量低？每孔可加到 30-50μg 蛋白（普通 WB 約 20μg），給抗體更多 "捕捉目標" 的機會。

抗體選優選斯達特：斯達特專有兔單B細胞抗體開發平臺，重組兔單抗，特意性高，靈敏度高，穩定性強，批間一致性好，是您WB 選擇。

2. 封閉與孵育的 "溫度哲學"

封閉液選 5% BSA（TBST 配制），奶粉可能藏著磷酸酶 "內鬼"；封閉 1 小時剛剛好，太久會 "遮住" 抗原表位。

4℃孵育過夜是 "黃金操作"：低溫讓蛋白穩穩 "粘" 在膜上，避免高溫導致的抗原脫落（PVDF 膜的物理吸附特性了解一下）。

3. 洗膜的 "溫柔藝術"

搖床轉速別太猛，洗滌時間別太長 —— 磷酸化蛋白本就 "脆弱"，過度沖洗會讓它們 "離家出走"。

斯達特磷酸化Duo套裝，包含100μl 總蛋白一抗+100μl 磷酸化蛋白一抗，助您輕松檢測蛋白磷酸化。

杭州斯達特志在為全球生命科學行業提供優質的抗體、蛋白、試劑盒等產品及研發服務。依托多個開發平臺：重組兔單抗、重組鼠單抗、快速鼠單抗、重組蛋白開發平臺（E.coli,CHO,HEK293,InsectCells）,已正式通過歐盟98/79/EC認證、ISO9001認證、ISO13485。

磷酸化蛋白檢測避坑全指南：從樣品到 WB 的硬核操作手冊