一、細(xì)胞特性及應(yīng)用

永生化人食管上皮細(xì)胞（NE2-hTERT）是一種通過 hTERT（人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶）基因轉(zhuǎn)染獲得的永生化細(xì)胞系。這種細(xì)胞系保留了正常食管上皮細(xì)胞的許多特性，同時(shí)具備無限增殖的能力。它在食管疾病研究、藥物篩選以及細(xì)胞生物學(xué)研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值。例如，可用于研究食管癌的發(fā)生機(jī)制、評(píng)估抗腫瘤藥物的療效等。

二、培養(yǎng)基的配制

選擇合適的培養(yǎng)基是成功培養(yǎng) NE2-hTERT 細(xì)胞的關(guān)鍵。通常使用以下培養(yǎng)基成分：

• 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：Keratinocyte Serum-Free Medium（K-SFM）或 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）

• 添加成分：

• 5% 胎牛血清（FBS）

• 1% 青霉素-鏈霉素溶液（Penicillin-Streptomycin）

• 0.5 ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子（EGF）

• 5 μg/mL 胰島素

• 0.1 mM 氯化膽堿

• 0.4 μg/mL 氫化可的松

配制時(shí)，需確保所有成分新鮮且無菌，避免污染。將上述成分按比例混合，并調(diào)節(jié) pH 至 7.2-7.4，即可用于細(xì)胞培養(yǎng)。

三、培養(yǎng)條件

（一）溫度和氣體環(huán)境

NE2-hTERT 細(xì)胞應(yīng)在 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CO? 的作用是維持培養(yǎng)基的 pH 穩(wěn)定。培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度應(yīng)保持在 95% 以上，以防止培養(yǎng)基過度蒸發(fā)。

（二）培養(yǎng)容器

選擇透氣性好、無毒且表面經(jīng)過處理的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶。在使用前，用 75% 的酒精對(duì)培養(yǎng)容器進(jìn)行消毒，并在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行操作，降低污染風(fēng)險(xiǎn)。

四、細(xì)胞的接種與傳代

（一）細(xì)胞的接種

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，確定合適的細(xì)胞接種密度。一般來說，NE2-hTERT 細(xì)胞的接種密度可在 5×103 - 1×10? cells/cm2 之間。將細(xì)胞懸液均勻地接種到培養(yǎng)容器中，確保細(xì)胞分布均勻。

（二）原代培養(yǎng)

將接種好的培養(yǎng)容器放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)初期，細(xì)胞可能會(huì)經(jīng)歷一個(gè)滯后期，生長(zhǎng)速度較慢。此時(shí)應(yīng)保持培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，避免頻繁擾動(dòng)細(xì)胞。定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，如細(xì)胞的形態(tài)、顏色以及是否有污染跡象等。

（三）細(xì)胞的傳代

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)容器表面的 80% - 90% 匯合時(shí)，即可進(jìn)行傳代操作：

1. 用無菌的 PBS 洗滌細(xì)胞 2 - 3 次。

2. 加入適量的 0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA 溶液，在 37℃下孵育 1 - 2 分鐘。

3. 在顯微鏡下觀察細(xì)胞的脫落情況，避免過度消化。

4. 加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕吹打制成均勻的細(xì)胞懸液。

5. 按照 1:2 - 1:3 的比例將細(xì)胞懸液分裝到新的培養(yǎng)容器中，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

五、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

（一）細(xì)胞的凍存

1. 在凍存前，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，無污染。

2. 用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。

3. 按照 5×10? - 1×10? cells/ml 的濃度將細(xì)胞懸液與凍存液（含 10% DMSO 的 FBS）混合。

4. 將混合好的細(xì)胞懸液分裝到凍存管中，每個(gè)凍存管裝 1 - 1.5 ml。

5. 使用程序降溫盒將凍存管放入 -80℃冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)移到液氮罐中保存。

（二）細(xì)胞的復(fù)蘇

1. 從液氮中取出凍存管，迅速放入 37℃水浴中快速解凍。

2. 解凍后的細(xì)胞立即用新鮮培養(yǎng)基稀釋并輕輕吹打混勻。

3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器中，加入適量培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞均勻分布。

4. 將培養(yǎng)容器放入 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24 小時(shí)內(nèi)避免頻繁操作。

六、常見問題及解決方案

（一）細(xì)胞污染

細(xì)胞污染主要來源于培養(yǎng)基、試劑、培養(yǎng)容器以及操作過程中的空氣。一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞受到細(xì)菌、真菌或支原體等污染，應(yīng)立即停止培養(yǎng)并處理。預(yù)防措施包括嚴(yán)格無菌操作、定期對(duì)培養(yǎng)環(huán)境和試劑消毒等。

（二）細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢

細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢可能由培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不足、細(xì)胞密度過高或過低、培養(yǎng)環(huán)境不穩(wěn)定等原因引起。解決方法包括檢查培養(yǎng)基質(zhì)量、調(diào)整細(xì)胞接種密度、保持培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定等。

（三）細(xì)胞形態(tài)異常

細(xì)胞形態(tài)異常可能提示細(xì)胞受到應(yīng)激、損傷或發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化。這可能與培養(yǎng)條件改變、傳代次數(shù)過多、病毒感染等因素有關(guān)。應(yīng)密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化，檢查培養(yǎng)條件是否符合要求，確保傳代次數(shù)在合理范圍內(nèi)，并及時(shí)處理受病毒感染的細(xì)胞。