ELIS試劑盒技術優勢及應用  
     ELIS試劑盒的歷史可以追溯到1963年Jerne等人創立的溶血空斑技術（hemo-lytic plaque forming cell assay，HPF），這項技術可用于檢測并計數單個抗體形成細胞。隨著單克隆抗體技術的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法檢測脾細胞中分泌特異性抗體的細胞數，發現該方法敏感性高簡便易行。后來，他們又用這種方法定量分析受到有絲分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的細胞數。隨后，用ELISPOT法在單細胞水平檢測分泌其他細胞因子（如IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，TNFα和IL-6） 數量的手段也被建立起來。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法來提高這種方法的敏感性，Herr用計算機輔助圖像分析系統（computer-assisted video image analysis，CVIA）自動分析TNF2α酶聯免疫斑點的大小和數量，計算與負載抗原肽的靶細胞接觸后外周血單核細胞（PBMC）中抗原特異性CD8+T細胞的數量，不但提高了對背景染色的分辨力也使大規模研究成為可能。Vaquerano等將數碼相機和計算機結合起來，開發出類似的斑點計數系統，認為當每孔斑點數大于100時，這種方法更客觀、可重復性高且節省時間。  
       隨著ELIS試劑盒技術的不斷發展，它的優勢也漸漸顯示出來，下面將列舉ELISPOT對比其它一些傳統技術的優勢所在。  
      ELIS試劑盒 分析使單細胞分泌產物可視化。這些分析異常敏感，因為它是在直接在分泌細胞的周圍進行捕捉，而且是在表面被沖淡，或者被臨近的細胞上的受體捕獲，或降解之前。zui低至1：100萬細胞精度的活體外頻率測量。這種分辨率已經遠遠超過使用細胞內細胞因子的四聚物染色和ELISA法測量的精度。這種高敏感度是非常關鍵的，因為抗原特異性 T 細胞在體外都是典型性的低頻率。高產量T細胞分析成為可行。一個經過訓練的相關實驗室小組可以測試成百的樣本中幾十種抗原的反應。只需要少量細胞，就可以用于通其他細胞學分析方法進行比較。例如，45毫升的血液就足以用于測試600種不同抗原/肽類物質的反應。可以定義CD4和CD8細胞的免疫因子指標。這是因為只需要少數細胞，分析就可以在高產量模式下進行。ELISPOT分析在篩選肽庫，繪制免疫因子方面是一個理想的工具。 用于確定抗原特異性T細胞的功能性親和力。這zui大可能受到肽類藥物刺激至50%的影響。可以用于研究未經藥物處理過的細胞的分泌過程。如果觀察到凈產量減少，可以確定這種區別是來自分泌細胞的減少，還是每個細胞分泌產量的減少。淋巴細胞在ELISPOT分析后依然存活。這使得分析之后進行增值，用于更進一步的分析、克隆或者低溫儲藏成為可能低溫儲藏后的人類淋巴細胞可以用于檢測，而不會丟失其功能。治療前和治療后的樣本可以并排進行測試，結果可以重復。  
（1） 與ELIS試劑盒  
       ELIS試劑盒 通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。ELISPOT 也是通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數斑點或通過計算機輔助的分析系統對斑點進行計數， 1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）由于是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內毒素的單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。   
與有限稀釋法（limiting dilution analysis，LDA）  
       LDA能夠對特異性CTL細胞進行定量，曾在很多年中被認為是CTL 檢測的“金標準”，它使人們能夠詳細了解免疫反應動力學和記憶毒性T淋巴細胞（memorial CTL， mCTL） 亞群的細胞周期。但該方法需要高強度抗原刺激， 這會加快效應CTL（eCTL）凋亡，且不能定量測定eCTL細胞數量或測定值偏低。其次，該方法較繁瑣，培養時間可長達2～3周，而且很容易造成T細胞數量損失。  
（2） 與四聚體法（Tetramer）  
       zui近幾年出現了MHC2Ⅰ類分子抗原肽四聚體法。該法的優勢在于迅速、直接、靈敏且特異性強，即使當體內mCTL水平低于1%，用MHC2Ⅰ抗原肽四聚體法仍可直接測到準確的值，比LDA 敏感度要高5～10倍。但該技術也存在較多應用上的困難：除了合成及穩定MHCⅠ類分子的技術困難外，zui主要缺點是表位的選擇。由于每次反應只能分析單一的抗原表位，而MHCⅠ類分子結合的各種表位，能否形成CTL反應，卻隨著基因背景及時間的變化而變化，因此選擇正確的表位就顯得尤為重要。優勢表位的篩選可以通過Elispot 來進行，但對整個肽庫進行掃描，并不是一件很容易的事。當然，生物信息學的運用對表位的篩選有很大的幫助。同時，有研究結果表明，并非所有經過Tetramer 鑒定的陽性細胞都有確切的功能， Tetramer陽性的細胞數是用ELISPOT分析能分泌INF2γ細胞數的10倍，其中很多是不表現功能的惰性細胞，可能代表了記憶型CTL前體細胞。Tetramer分析只增加了分析的靈敏度，同時測定其功能很重要。  
（3） 與Cr51釋放法  
       此法是一種比較經典的方法，雖然在檢測CTL識別的抗原多樣性方面非常有效，且能闡明被CTL識別的*表位，但至多為半定量的層面，而且Cr51標記細胞的自發釋放率較高，不適于較長時間培養；標記時所需的細胞濃度較高，因而給試驗帶來諸多不便；此外，Cr51釋放法所測定的是一個細胞群體的特性，而不是單個細胞。  
（4） 與胞內CK染色法  
       與ELISPOT法相比較，胞內CK染色法（intra-cellular CK staining，ICS） 主要應用細胞內累積細胞因子的染色和多色參數的FACS法，是檢測循環淋巴細胞中抗原特異性T 淋巴細胞的可行方法，而ELISPOT法卻可以檢測所有分泌CK的eCTL 。  

應用  
       目前，ELISPOT已被用于檢測藥物、化學制劑及其它CK復合物的特性及功能等方面，因此為體內免疫功能的調節效應提供了檢測依據。近幾年來， ELISPOT技術在腫瘤疫苗評價試驗、免疫監測及免疫學研究中越來越被廣泛地使用。  

（1） 在抗腫瘤免疫及相關領域中的應用  
      在許多研究中，該技術已被用于免疫動物外周血淋巴細胞中抗原特異的細胞毒性T細胞（CTL）的數量檢測。近期，ELISPOT技術已用于分析和評價從傳染病病人的PBMC中檢測肽特異的T淋巴細胞以及在癌癥病人中誘導腫瘤特異的T細胞的疫苗試驗。  
ELISPOT檢測T細胞反應時敏感性、特異性和可重復性都很高，操作簡單迅速，需要少量標本，在檢測抗原特異性細胞數量的同時也反應其功能，并與臨床結果相關。ELISPOT平板可以提前大量準備，移液、洗板和讀板都可自動化，因而大批量檢查也可做到快速。在與與其他方法的比較后，ELISPOT很可能成為定量分析腫瘤或病毒特異性的T細胞反應的。  
（2） 在抗感染免疫中的應用  
       CTL在抗病毒感染的免疫應答中占有主要地位，而CD4+輔助性T細胞亞群Th1/Th2的平衡在抵御病毒感染中起著同樣重要的作用。在HIV研究方面，由MHC-1類分子加工的不同抗原經CTL識別并產生免疫應答在控制HIV-1感染中同樣起重要作用。利用ELISPOT方法檢測CK如IFN2γ就可以進一步了解到針對HIV特異的CTL應答及相關免疫信息。  
       此外，ELISPOT法還用于評價由HIV-1感染引起粘膜的CD4+T細胞免疫應答以及HIVgp 120g與霍亂毒素共表達的DNA疫苗的免疫源性。在其他研究中，ELISPOT還用來檢測通過直腸免疫低劑量甲肝疫苗而產生的細胞免疫應答。在急性的自限性肝炎中，以Th1為主的應答促進細胞介導的免疫，且在控制病毒感染及延緩慢性疾病的發展方面有重要作用。  
       在許多抗細菌免疫研究中，該方法也發揮了重要作用。例如：應用ELISPOT試驗證實表達大腸桿菌MalE蛋白的重組卡介苗（rBCG.MalE）誘導的T細胞應答是CD4+T細胞依賴的，rBCG.MalE 誘導的特異CD4+T細胞應答存在Th1/Th2平衡轉換現象，并逐步形成Th1/ Th2 混合應答。  
（3） 臨床方面  
       目前，已經實現臨床檢驗的領域是對肺結核（TB）的檢測。而zui近的研究熱點就是對于移植的預測。受體對供體特異性HLA抗體一直以來都是器官移植的一大障礙，因為它們的存在不僅介導超急性排斥反應而且還可導致急性排斥反應。因此，HLA抗體的存在限制了異體抗原敏感患者對供體器官的需要，因而增加了等待移植的時間。在心臟，肝臟和腎臟異體移植后早期出現的并發癥如急性排斥反應與移植前存在的異體免疫臨床相關性迫切需要一種恰當的檢測方法在器官移植前能了解受體對供體特異性體液免疫的功能狀態。  
    在接受移植的人群中，部分因有多次輸血、或既往有異體移植失敗或多次妊娠史體內曾經存在陽性異體抗體，在他們接受異體移植時，現有的檢測方法只能顯示他們對異體的免疫功能正常。但他們體內存在記憶B淋巴細胞，一旦受到相應HLA 抗原的刺激則會喚起免疫反應，這不僅影響著移植的結果，甚至會出現危及患者生命的、與移植相關的并發癥。  
    ELISPOT是一種強有效的檢測單個抗體分泌細胞的方法，具有很高的敏感性。因此，刺激記憶B淋巴細胞增殖、分化成漿細胞，并建立一種特異性ELISPOT方法檢測HLA抗體產生細胞是*手段。 如果ELISPOT要進一步推廣應用，特別是臨床應用，其標準化將是一個十分重要的問題。美國FDA和NIH等已經開始建立ELISPOT的標準化流程，相信隨著ELISPOT技術的成熟、標準化程序的建立，它的應用將更加廣泛。  



ELISPOT 實驗方案  

對應BD的試劑盒  
實驗材料的準備  
試劑盒中沒有但是必須的  
材料:    
• 已消毒的移液器 （Gilson）。單道20ul,100ul,200ul,1ml, 8/12道200ul  
• 無菌一次性聚苯乙烯吸量管 （1ml, 5ml, 10ml）（Axygen）。  
• 一次性乳膠手套 。  
• 無菌一次性離心管（15ml、50ml）（Corning cat#430052 and 430290）。  
• 吸水紙（衛生紙）  
• 無菌tip頭, 200ul,1ml,  

    試劑:  
1.        PBS 無菌 300ml/10板，有菌4000ml/10板 在準備包被抗體時不要使用商業化的PBS  
2.        ddH2O（無菌） 對于10塊ELISPOT板，200 ml  
3.        有菌洗滌緩沖液（PBST）：有菌3000ml/10板  
Tween-20 進口  
4.        有菌洗滌緩沖液（PBS）：有菌1000ml/10板  
5.        培養液：無血清培養基 （P/S, 2 mM 的谷氨酰胺，以及 Hepes buffer）。  
6.         PMA ＋ionomycin.  
    Phorbol 12-myristate 13-acetate （PMA; Sigma Chemical Co., product nr. P8139 is recommended）.  
PMA   
貯 存 液：PMA溶于DMSO，濃度為1mg/ml，-20℃保存  
工 作 液：貯存液 1:4000稀釋于無血清培養基中  
此時為 250ng/ml   
 Calcium ionophore （ionomycin; Sigma Chemical Co, product nr. I0634 is recommended）.  
Ionomycin   
貯 存 液：Ionomycin溶于DMSO，濃度為1mg/ml，-20℃保存  
工 作 液：貯存液 1:200稀釋于無血清培養基中  
此時為 5μg/ml   
50ml混合刺激劑＝PMA工作液12.5ul，Ionomycin工作液250ul，無血清培養基補齊  


7.        10% 熱滅活胎牛血清 （Hyclone cat# ALH14384 ）  
8.        抗原  
       
設備:  
• 洗板器: 自動或手動 （洗瓶, 手動分液器等）。  
•CO2-細胞培養箱 （37°C）。  
4°C冰箱  
無菌間無菌操作臺  



Preparation kit reagents    
1．包被用抗體  
取50 μl加到10ml PBS中。（足夠包被1塊96孔板，100 μl/well）。  
對10塊板子， 500ul加到100ml PBS中  
2．生物素標記的檢測抗體（detector antibody）  
取50μl加到10 ml  Dilution buffer中。（混勻后加入ELISPOT板，100 μl/well）。  
對10塊板子， 500ul 加到100ml Dilution buffer（PBS+10%FBS）  
3．STREP-HRP  
取100μl加到10 ml  Dilution buffer中。（混勻后加入ELISPOT板，100 μl/孔）。  
對10塊板子， 1ml 加到100ml Dilution buffer  

4 顯色激活系統（Activation system）  
對于1塊ELISPOT板，200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混勻，10分鐘內用完。（100 μl/孔）。  

ELSPOT實驗步驟  
Day 1   
包被ELISPOT板 16：30  

1.        在ELISPOT板中每孔加入包被抗體100μl，4℃。  
Day 2  
ELISPOT板的封閉  17：00  

2.        取出已包被的ELISPOT板，吸棄每孔中的包被抗體溶液。  
3.        用*無血清培養基洗1次。  
4.        在ELISPOT板中，每孔加入200μl*無血清培養基。室溫2h。（8道排槍）  
5.           
PBMC加入ELISPOT培養板 20：00  

6.        取出封閉2h的ELISPOT板，吸棄每孔中的封閉液。（不要洗板！）  
7.        在ELISPOT板中，先加30μl 無血清培養基（12道排槍）和20μl肽庫（8道排槍），后加50μl細胞（8道排槍） （每孔活細胞總數為2×105，每個病人需活細胞總數為10×106，體積為2.5 ml。每條多肽的終濃度為5μg/ml，活細胞的工作濃度為4×106/ml，活細胞的終濃度為2×106/ml）。  
陽性孔中每孔加入50μl 細胞和30μl無血清培養基和20μl PMA+Inomysin（工作液濃度分別為250ng/ml和5ug/ml，終濃度分別為50ng/ml和1ug/ml）。  
8.        用low evaporation lid 蓋好ELISPOT板，放入37℃ CO2孵箱培養30 h。  
注意：不要晃動ELISPOT板。 

Day 4   
二抗和GABA標記，顯色反應 8：30  
9.        培養30h后，取出ELISPOT板，甩去細胞后。  
10.    用去離子水洗滌2次。每次浸泡5分鐘。  
11.    用0.05％PBST洗滌3次。每次浸泡2分鐘。  
12.    每孔加入100μl 生物素化的detector Ab（8道排槍）。室溫2小時。  
13.    取出ELISPOT板，倒去detector Ab溶液，用PBST洗滌3次。每次浸泡2分鐘  
每孔加入100μl Strep-HRP溶液（8道排槍）。室溫1小時  
14.    取出ELISPOT板，倒去Strep-HRP溶液。  
15.    PBST洗滌4次。每次浸泡2分鐘。  
16.    用PBS洗滌2次。每次浸泡2分鐘。  
17.    洗滌完畢后，在吸水紙上輕輕拍干ELISPOT板。  
每塊板子200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混勻，15分鐘內用完。  
18.    每孔加入100 µl 配好的substrate（8道排槍）。在暗處、室溫下孵育（5～60分鐘）。  
出現斑點后，用自來水沖洗，中止反應。室溫下干燥，檢測。