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士鋒生物細菌總DNA的提取和鑒定實驗介紹

來源:上海士鋒生物科技有限公司   2014年02月21日 07:22  

(一)試劑:
菌株(E.coli );蛋白酶k(20mg/ml);瓊脂糖;標準DNA水解液
1.10%SDS
2.酚/氯仿/異戊醇(1/1/1)
3.異丙醇;70%乙醇
4.LB培養基:蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g加蒸餾水至1升,然后滅菌備用。
5.TE緩沖液:10mM Tris• HCl,0.1mM EDTA (pH8.0)。
6. CTAB/NaCl溶液(5% w/v):5g CTAB 溶于100ml 0.5M NaCl溶液中,需要加熱到65℃使之溶解,然后室溫保存。
7.TAE緩沖液(50×)(pH8.0):每升溶液中含有242g Tris,57.1ml 冰乙酸,100ml 0.5mol/L EDTA。電泳時稀釋成1× 濃度使用。
8.溴酚蘭-甘油指示劑:先配制0.1%溴酚蘭水溶液,然后取1份0.1%溴酚蘭溶液與等體積的甘油混合即成
9.0.5μg/ml 溴乙啶染液:稱取5mg溴乙啶,用重蒸水溶解定容到10ml,取1ml此溶液用1xTAE緩沖液稀釋到1升,zui終濃度為0.5μg/ml。
(二)器材:
錐形瓶(250ml),1.5ml 離心管,水浴鍋,離心機,電泳槽,電泳儀,搖床,移液槍,潔凈工作臺,電磁爐,紫外成像儀
【實驗方法】
(一)細菌總DNA的提取
1.將菌株接種于液體LB培養基,37℃震蕩培養。
2.取1.5ml培養物12000rpm離心2min。
3.沉淀物加入567μl的TE緩沖液,反復吹打使之重新懸浮,加入30μl 10%SDS和15μl的蛋白酶K,混勻,于37℃溫育1h.
4.加入100μl 5mol/L NaCl,充分混勻,再加入80μl CTAB/NaCl溶液,混勻后再65℃溫育10min。
5.加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻,離心4-5min,將上清轉入一只新管中,加入0.6-0.8倍體積的異丙醇,輕輕混合直到DNA沉淀下來,沉淀可稍加離心。
6.沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后,離心棄乙醇,在潔凈工作臺中稍加干燥,重溶于20μl TE緩沖液(含RNaseA-25ng/ml)中,準備電泳檢測。
(二)瓊脂糖凝膠電泳
1.制膠:稱取瓊脂糖粉末,置于三角瓶中,加入TAE緩沖液配成0.8%的濃度,加熱使瓊脂糖全部融化于緩沖液中,待溶液溫度降至65℃時,立即倒入制膠槽中,插入樣品梳。在室溫放置0.5-1h,待凝膠全部凝結后,輕輕拔出樣品梳。然后在電泳槽中加入電泳緩沖液直到沒過凝膠為止。
2.加樣:取0.5-1μg 左右的樣品,體積為10-20μl,加入1/4體積的溴酚蘭-甘油指示劑,混勻后小心地加到樣品槽中。同時另取一個已知分子量的標準DNA水解液,在同一凝膠板上進行電泳。
3.電泳:維持恒壓100V,電泳0.5-1h,直到溴酚蘭指示劑移動到凝膠底部,停止電泳。
4.染色:
將凝膠取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中,染色0.5-1h。染液可反復多次使用。
5.觀察:
將凝膠板置于254nm波長紫外燈下進行觀察。DNA存在的位置呈現橙黃色熒光。
【注意事項】
1.溴乙啶有毒,配制和使用溶液時要戴手套,勿將溶液滴灑在臺面或地面上。溴乙啶溶液于室溫保存在棕色瓶中。
2.倒凝膠板時不要太厚,否則影響電泳效果。

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