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實現多重檢測 我國推動實時熒光PCR技術再上新臺階
2022年03月23日 10:01:42
來源：化工儀器網 作者：宋池 點擊量：5500
近期，廈門大學研究團隊成功研發出一種熒光PCR新技術，將熒光PCR的單管檢測能力提高了至少一個數量級，推動了主流熒光PCR儀器檢測技術的發展。
【化工儀器網 項目成果】近期，廈門大學研究團隊成功研發出一種熒光PCR新技術，將熒光PCR的單管檢測能力提高了至少一個數量級，推動了主流熒光PCR儀器檢測技術的發展。研究成果發表在《美國國家科學院院刊》(PNAS)雜志上。
作為目前最為成熟、臨床應用最廣泛的分子診斷技術，PCR(聚合酶鏈式反應)技術具有靈敏度高、特異性好、及時方便等優點，在傳染性疾病檢測、腫瘤個體化診療、遺傳性疾病篩查、血液篩查等領域有著巨大的應用價值，已經成為許多臨床診斷的“金標準”。在疫情期間，PCR技術在病毒核酸檢測中發揮了重要作用，其發展也更受重視。
PCR技術發展至今已經衍生出多重PCR (multiplex PCR)、實時熒光定量PCR、數字PCR(digital PCR)等多種技術。其中第二代技術——實時熒光定量PCR是當前的主流。該技術通過特異性熒光探針實時監測擴增片段熒光信號，同時實現了絕對基因表達和相對定量檢測。同時通過閉管檢測的模式降低了擴增產物的污染機會，節省時間和勞動力，有利于自動化的實現。
然而實時熒光定量PCR的檢測能力受限于儀器檢測通道數目，單個反應能檢測到的靶基因數量很難超過6個(2-4)。在PCR之后添加熔解分析步驟是研究者解決這一問題的嘗試，雖然在一定程度上增加了可檢測靶基因數目，但也存在檢測成本升高、檢測錯誤率增加等問題。靶基因檢測數量的局限使實時熒光定量PCR技術在涉及多靶點的復雜疾病檢測中難以發揮作用。
2022年2月24日，廈門大學生命科學學院研究團隊在《美國國家科學院院刊》(PNAS)雜志上發表了一項研究成果，報道了一種稱為“MeltArray”的單步、多重均相熒光PCR新技術。
該技術利用了熒光PCR反應中Taq DNA聚合酶的5‘-瓣狀內切酶活性，將位于引物下游的“媒介探針”切割，釋放出“媒介引物”，“媒介引物”結合到反應體系中的分子信標報告探針上。在Taq酶聚合活性作用下，“媒介引物”沿著分子信標延伸，生成具有特定熔點值的熒光雙鏈。由于每個分子信標可以允許多個“媒介引物”形成一系列具有不同熔點值的熒光雙鏈，單個MeltArray多重熒光PCR反應可檢測的總靶基因數目就等于反應中分子信標數量乘以其所容納的“媒介引物”數量。
為驗證MeltArray的多重檢測能力，研究者設計了多種檢測體系，包括人類Y染色體微缺失的20重檢測、確定大腸桿菌血清型的62重檢測、同時識別和定量呼吸道病原體的24重檢測、直腸癌組織樣本的KRAS突變微測序分析等，對應了分子診斷的遺傳病、傳染病和腫瘤分子診斷三大應用領域，均有良好的靈敏度和特異性。
在高通量測序技術出現后，靶基因檢測數量有限的實時熒光定量PCR通常被認為是“低端”的檢測技術。MeltArray不需要改變現有的熒光PCR儀器就極大增加了單個閉管實時熒光PCR一步法能檢測的最大靶基因數量，推動熒光PCR這一“老技術”再上“新臺階”，填補了長期存在于低階PCR和高通量檢測二者之間的技術空白。
(資料來源：科技部生物中心、IVD從業者網)
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